Summary
sialidase 분석은 미생물의 감염 라이브 macrophages의 세포 표면에 수용체 수준에서 염증성 질환에 관여 TLR 센서 소설 분자 메커니즘 (들)을 명료하게하다하는 간단한 기술 접근이다.
Abstract
포유류의 수신자 같은 수용체 (TLRs)는 병원균 - 관련 분자 패턴을 인식 수용체의 가족입니다. 뿐만 아니라 TLRs는 미생물의 중요한 센서 (예, 바이러스, 세균 및 기생충) 감염되며, 그들은 또한 가능성이 면역 질환으로 전염성 질환, 염증 질환, 그리고 pathophysiology에 중요한 역할을한다. 따라서, 감염증에 대한 TLR의 반응의 강도와 기간은 강력히 제어해야합니다. 이 센서 수용체들은 리간드 상호 작용과 신호 구성 요소의 구조적 무결성을 이해하는 것은 이후의 면역 보호를 위해 필수적인 것이 다음과 같습니다. 또한 센서 조작을 통해 질병 조작을위한 중요한 기회를 제공합니다. TLR 센서의 신호 경로가 잘 묘사되고 있지만, 매개 변수는 센서와 그 리간드 여전히 저조한 정의 남아 사이의 상호 작용을 통제. 우리는 최근 이전에 1,2을 관찰되지 않은 자연 리간드에 의해 TLR 활성화의 소설 메커니즘을 확인했습니다. 그것은 리간드 유도된 TLR 활성화가 밀접하게 Neu1 sialidase 활성화에 의해 제어됩니다 것을 제안합니다. 우리는 또한 Neu1가 단단히 Neu1 및 매트릭스 metalloproteinase - 9 (MMP - 9) 수용체 4 단지에 간 이야기를 포함 TrkA와 TrkB 3 번 neurotrophin 수용체를 조절보고있다. sialidase 분석 처음 GPCR Gαi 단백질 및 MMP - 9 5를 통해 macrophages, 돌기 세포 fibroblast 세포의 세포 표면에 Neu4 sialidase의 활성화에 새로운 리간드, thymoquinone를 찾을 사용되었습니다. TLR 수용체에 대한 우리의 데이터는 Neu1 sialidase는 TLR - 2, -3 및 -4 수용체 복잡한 이미이며, 두 수용체에 리간드 바인딩에 유도되고있는 것으로 나타났습니다. 활성 Neu1 sialidase의 hydrolyzes sialyl α - 2 TLR - 4 dimerization, MyD88/TLR4 복잡한 채용, NFkB의 활성화와 프로 염증성 세포 반응에 steric hinderance를 제거하는 바인딩 리간드에서 멀리 ,3 - 링크 β - galactosyl 잔류물. 공동 보고서에서 Neu1의 sialidase는 대식 세포 세포 6 phagocytosis 조절을 보여줘왔다. 함께 촬영 sialidase 분석은 리간드 유도된 수용체 활성화의 분자 메커니즘에 강력한 통찰력으로 우리를 제공합니다. Neu1 sialidase과 TLR의 활성화 사이의 정확한 관계가, Trk 수용체는 아직 완전히 elucidated 수 있지만, 그것은 세포 규제 경로에 신규 또는 선구적인 접근 방식을 나타내는 것입니다.
Protocol
1. 냉동 세포 대식 세포의 세포를 부활
- -80에서 냉동 세포를 부활하기 전에 ° C 냉장고 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 5 μg / plasmocin의 ML과 보충 살균 필터 Dulbecco의 수정된 이글의 중간 (DMEM)을 사용하여 배지를 준비 하나 필요합니다. Plasmocin은 세포의 문화 mycoplasma 오염을 제거하고 방지하기 위해 우리의 연구에 사용되는 항생제 솔루션입니다.
- 냉동 세포 중 하나가 병에 들어, 4 ML, 살균 생물 학적 봉쇄 후드에서 25cm 2 세포 배양 플라스크에 교양 매체 1 ML을 추가합니다.
- 냉동 세포의 유리병은 -80 ° C의 냉동고에서 가져온 경우, 그들은 빠르게 약 2-3 분 소요 멸균 후드에 손 온난화에 의해 해동됩니다.
- 즉시 세포가 해동되면서, 그들은 신속하게 1mL 피펫을 사용하여 살균 시설이 매체를 포함하고있는 술병으로 전송됩니다.
- 세포를 포함하는 플라스크는 37 ° C와 5% CO 2에서 조직 문화 인큐베이터에 배치됩니다.
- 그들이 거꾸로 현미경을 사용하여 75 % 90% 합류가 될 때까지 세포는 매일 성장과 준수를위한 검사.
- 세포 배양 보육 동안, 12mm 원형 유리 슬라이드는 생물 학적 봉쇄 캐비닛에 1 시간을 위해 큰 유리는 배양 접시에 70 % 에탄올에서 그들을 다루는 소독 있으며, 알코올은 나중에 제거 reusage 보관하고, 젖은 유리 측면입니다 24 시간 또는 그들이 건조 때까지 UV 아래 캐비닛에 멸균 필터링 공기 흐름에 노출 남아 있습니다.
2. Sialidase 분석을위한 도금 셀
- 세포를 도금하기 전에 하나의 무균 원형 유리 슬라이드는 신중하게 스테인레스 스틸 forcep, 톱니 모양의, "4, 소독 불타는 전체 곡선을 사용하여 BD 팰컨 잘 하나 24 잘 뚜껑이있는 평면 바닥 조직 문화 처리 폴리스티렌 판 배치됩니다 . 75 %에 합류 세포 중 하나가 술병을 위해, 우리는 대개 문화 판 12 우물을 사용합니다.
- 자기편 대식 세포 세포 들어, DMEM 시설 매체는 멸균 용기 캐비닛에 5 ML 멸균 피펫을 사용하여 플라스크에서 제거됩니다. 1X 무균 트리스와 함께 한번 자기편 세포를 씻고있는 혈청이 포함된 미디어를 제거하고 세포를 감추기에 충분 할만큼 산도 7.4에서 호수 버퍼 칼슘 매체 무료 (CMF) 인산 1 ML를 추가하는 생리 산도 7.4이 버퍼. 세포는 술병에서 발사 전까지는 세포는 약 10 분 또는 37 ° C 배양기에 배치됩니다. 플라스크는 부드럽게 누볐어이나 남아있는 자기편 세포를 풀어야 흔들리고 수 있습니다.
- 술병에서 중단 세포의 제 1 ML하려면, DMEM 시설 중간 3 ML를 추가합니다. 정지 세포의 0.5 ML를 타고 sterilely 12mm 원형 유리 슬라이드를 포함하는 조직 교양 판에게 양도. 약 0.5 X 10 6 세포는 원형 유리 슬라이드로 전송됩니다.
- 조직 배양 플레이트 포함하는 세포는 37 incubated 아르 ° C 5 % 세포가 원형 유리 슬라이드에 충실하기 위해 수 있도록 24 시간에 대한 CO 2.
3. Sialidase 분석
1. 컨트롤 만들기
- 봉쇄 캐비닛 또는 실험실 벤치에서 순서대로 다음과 같은 성분 혼합하여 추가 : (1 엔드, 1slide, 25 X 75 X 1mm 프로스트) : 현미경 슬라이드를 삽입 4 MUNANA 1 μL DAKO + 1 μL를 끝으로 + 트리스 3 μL는 생리 산도 7.4 (TBS)을 버퍼.
- 잘 세포를 포함하는 하나의 미디어를 제거한 후, 부드럽게 잘의 모퉁이에 4 "forcep으로 원형 유리 슬라이드 리프트. 조심스럽게 forcep으로 유리 슬라이드를 제거 및 혼합 솔루션에 직면하고있는 세포로 슬라이드를 장소 현미경 슬라이드.
- 바로, UV 필터 설정하고 형광 이미지를 캡처를위한 디지털 카메라를 가지고있다 에피 형광 현미경으로 microcope 슬라이드 가져가라.
- 당신은 형광등 모드로 전환 후 세포를 볼 수 있고 때까지 위상 대조에서 현미경을 집중. 1 분, 2 분, 3 분 형광등 아래에있는 세포의 사진을 가져가라. 위상 대조 아래 세포의 단일 사진을 가져가라.
2. 긍정적인 테스트 만들기
- 4 MUNANA 1 μL DAKO + 1 μL LPS의 + 2 μL + TBS 1 μL : 다른 현미경 슬라이드에있는 순서대로 다음과 같은 화합물 스팟.
- 위의 단계 3.1.2에 3.1.4를 반복합니다.
3. Neuraminidase 억제제는 Tamiflu와 함께 긍정적인 테스트 만들기
- 다른 현미경 슬라이드에 다음과 같은 순서에 다음과 같은 화합물을 스팟 : 4 MUNANA의 1μL DAKO + 1μL + LPS 2 μL + Tamiflu 1 μL.
- 원형 유리 슬라이드에 살고 세포와 접촉하는 물질의 최종 농도가 5 희석 계수를해야합니다, Tamiflu의 농도는 생리 산도 7.4 버퍼 1X 트리스의 사전 준비.
- 위의 단계 3.1.2에 3.1.4를 반복합니다.
4. 억제제의 농도의 결정은 Sialidase 활동의 50 % (IC 50) 억제하는 데 필요한
- 세포를 둘러싼 형광을 계량하기 위해 이미지는 RBG을 측정하는 분석 플러그인과 ImageJ 1.38x를 사용하여 분석하고 있습니다. 세포를 둘러싸고있는 형광 50 무작위 현장 판독을 가지고 총 형광의 평균을 계산합니다.
- IC 50 비선형 회귀를 사용하여 Y 축의 평균 형광으로부터 X 축에 (예를 들어, 로그 NG / ML) 로그 단위로 변환 억제제 농도의 플롯에서 생성됩니다.
5. 성공의 비밀
- 문화의 세포가 mycoplasma에서 무료로 오염되어 있는지 확인하십시오. 우리는 일상적으로 이에 대한 제어하는 문화 매체 Plasmocin을 사용합니다.
- 인공 neuraminidase 기판, 4 MUNANA는 신선한 사용해야합니다. 준비 기판은 sialidase 분석을위한 일주일 이내 사용할 수 있습니다.
- 세포주의 세포 표면에 낮은 수용체 표현이있다면, 하나는 자극에 대한 리간드의 높은 복용량을 사용할 수 있습니다.
- 우리는 또한 이상의 여섯 번 passaged 세포들의 수용체 표현형을 잃을 수도 경험이있다. 갓, 부활 전지 교양하여야한다.
6. 대표 결과
첨부된을 대표하는 결과 sialidase 분석의 애니메이션 프로토콜 참조 PowerPoint 파일을 .
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Discussion
라이브 대식 세포 세포 2 sialidase 활동을 감지하기 위해 새로 개발된 분석을 사용하여, 우리는 BMC - 2 복용량에 의존 방식으로뿐만 아니라 사는 대식 세포의 세포 DC - 2.4 돌기 세포에 거주 리간드 유도된 sialidase 활동에 sialidase 활동을 감지하는이 기술을 사용 , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 내유 선암 세포, 인간 WT 및 1140F01 및 WG0544 종류 I sialidosis의 fibroblast 세포. Tamiflu (oseltamivir 인산염)과 같은 Neuraminidase 억제제는 IC 50 0.0194의 μm의와 함께 BMC - 2 세포가 neuraminidase 억제제 데이 (2 - 데옥시 - 2 ,3 - dehydro위한 19.17 μm의의 IC 50와 비교하여 사는 thymoquinone 유발 sialidase 활동을 저해 DN - acetylneuraminic 산성) 5. 우리는 또한 특정 안티 Neu1, -2, 3 항체와 같은 다른 응용 프로그램에서 사는 BMC - 2 및 인간 TQ 유발 sialidase 활동에 대한 억제 THP - 1 세포 대식 세포의 세포가 없다는보고가 있지만 안티 Neu4 항체가 완전히이 활동을 차단합니다. 라이브 차 골수 (BM) 보조 Neu1 결핍증 (NeuI KD)와 쥐가 아니라 Neu4 녹아웃 (에서 WT 및 hypomorphic 카텝신에서 파생된 대식 세포의 세포를 치료 TQ과 관련된 활발한 sialidase 활동을 감지하는 sialidase 활동의 응용 프로그램있다 Neu4 KO) 마우스 1,2,5. 또한, 백일해 독소 (PTX), G - 단백질 결합 수용체 (GPCR)와 매트릭스 metalloproteinase (MMP) galardin과 piperazine의 다양한 억제제의 Gαi 단백질의 특정 억제제는 THP - 1 기본, BMC - 2 생활에 적용 BM의 대식 세포의 세포가 완전히 TQ 유발 sialidase 활동 5 블록. 이러한 동일한 억제 효과는 GM1 ganglioside 특정 콜레라 독소 subunit B (CTXB)뿐만 아니라 CTX와 티로신 키나제 억제제 K252a, 그리고 다양한 GPCR 억제제 suramin와 관찰되지 않습니다. 특정 MMP - 9의 억제제 방지 MMP - 9 항체 및 안티 Neu4 항체 아니지만 사는 MMP - 3을 완전히 차단 TQ 유발 sialidase 활동의 구체적인 억제제 THP - 1에 Neu4와 MMP - 9을 표현하는 세포 세포 표면 5.
함께 촬영 sialidase 분석은 리간드의 특성에 따라 Neu1 또는 Neu4 같은 sialidases 관련된 리간드 유도된 수용체 활성화의 분자 메커니즘에 강력한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 리간드 - 바운드 수용체에 의해 중재 리간드 유도된 sialidase 활동의 인텔리는 NGF TrkA, BDNF TrkB 및 수신자와 같은 수용체와 같은 glycosylated 수용체는 리간드 - 바운드 수용체의 분자 조직 플랫폼을 포함하는 세포 표면 막에 신호 패러다임을 형성하는 것이 좋습니다 , Gαi 단백질, MMP - 9과 Neu1 또는 Neu4 sialidase. 리간드 바인딩 각각의 수용체가 막 Gαi 단백질 및 MMP - 9 활성화를 통해 GPCR - 신호를 통해 sialidase 활동을 유도. Neu1 또는 Neu4와 MMP - 9 세포 표면에 수용체와 복잡한에 간 이야기는 기능적 수용체를 생성 수용체 협회 sialic 산성 - steric의 hinderance를 제거하는 sialidase의 급속한 활성화를 수 있습니다.
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Disclosures
SRA와 PJ 똑같이 첫번째 저자로 기여.
Acknowledgments
MRS을 부여하여 부분 지원 자연 과학, 캐나다 공학 연구 협의회 (NSERC), 신경 과학 연구, ARC에 대한 해리 Botterell 재단, 그리고 가필드 켈리 순환기 연구 및 개발 기금에서입니다. SRA는 여왕의 대학 연구 대상과 로버트 J. 윌슨의 원정받는 사람입니다. PJ는 여왕의 졸업 수상과 로버트 J. 윌슨의 원정받는 사람입니다. AG와 SA는 여왕의 대학원 수상 수상자입니다. SF는 과학 기술 (OGSST)에서 온타리오 대학원 장학금받는했다. AG는 여왕의 프랭클린 브래켄 대학원 장학금받는 것입니다. SA는 여왕의 RS 맥롤린 대학원 장학금받는 것입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 4-MUNANA | Biosynth International, Inc | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | ||
| DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | 15 mL |
| Tamiflu (Oseltamivir Phosphate) | Hoffmann-La Roche AG |
References
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- Amith, S. R. Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase. Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).
- Woronowicz, A. Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase. Glycobiology. 17, 10-24 (2007).
- Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling. Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).
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