איתור פעילות Neu1 Sialidase בוויסות חיוג כמו הפעלת קולטן

Summary

Assay sialidase היא גישה טכני פשוט כי יהיה להבהיר המנגנון המולקולרי רומן (ים) של חיישנים TLR של זיהומים מיקרוביאליים ומעורבות מחלות דלקתיות ברמת הקולטן על פני התא של מקרופאגים לחיות.

Abstract

היונקים קולטני Toll-כמו (TLRs) הם משפחה של קולטנים המזהים פתוגנים הקשורים דפוסי מולקולרית. לא רק TLRs חיישנים מכריע של חיידקים (כגון וירוסים, חיידקים טפיל) זיהומים, הם גם ממלאים תפקיד חשוב בפתופיזיולוגיה של מחלות זיהומיות, מחלות דלקתיות, ואולי גם מחלות אוטואימוניות. לפיכך, עוצמת ומשך תגובות TLR נגד מחלות זיהומיות חייבים להיות מבוקרים היטב. מכאן להבנת השלמות המבנית של קולטנים חיישן, אינטראקציות ליגנד שלהם ורכיבים איתות חיוני להגנה החיסונית שלאחר מכן. זה יהיה גם לספק הזדמנויות חשובות עבור שינוי המחלה באמצעות מניפולציה חיישן. למרות מסלולי איתות של חיישנים TLR מאופיינים היטב, הפרמטרים השליטה אינטראקציות בין חיישנים ligands שלהם נותרו מוגדרות היטב. זיהינו לאחרונה מנגנון חדשני של הפעלת TLR על ידי ליגנד הטבעי, שלא נצפתה בעבר ^1,2. זה מצביע על כך ליגנד-Induced ההפעלה TLR נתונה לפיקוח הדוק על ידי הפעלת Neu1 sialidase. יש לנו עוד דווח כי Neu1 בחוזקה מווסת רצפטורים neurotrophin כמו TrkA ו TrkB ^3, אשר כרוך Neu1 והמטריקס metalloproteinase-9 (MMP-9) צולבות לדבר מורכב עם קולטנים ^4. Assay sialidase כבר בתחילה להשתמש כדי למצוא thymoquinone רומן, ליגנד, בשנת ההפעלה של sialidase Neu4 על פני התא של מקרופאגים, תאים דנדריטים ותאי פיברובלסטים דרך GPCR Gαi חלבונים MMP-9 ^5. עבור קולטני TLR, הנתונים שלנו מצביעים על כך Neu1 sialidase כבר מורכבים עם קולטני TLR-2, -3 ו -4, והוא המושרה על הכריכה ליגנד לקולטן אחד. הופעל Neu1 hydrolyzes sialidase sialyl α-2 ,3-linked β-galactosyl שאריות רחוקים ליגנד מחייב להסיר hinderance סטרית כדי dimerization TLR-4, MyD88/TLR4 גיוס מורכבים, ההפעלה NFkB ופרו דלקתיים תגובות התא. בדו"ח משותף, sialidase Neu1 הוכח להסדיר phagocytosis בתאים macrophage ^6. יחדיו, assay sialidase סיפק לנו תובנות רבות עוצמה המנגנונים המולקולריים של הפעלת ליגנד-Induced הקולטן. למרות הקשר המדויק בין sialidase Neu1 ואת ההפעלה של TLR, TRK קולטנים טרם הובהר באופן מלא, זה היה לייצג גישה חדשה או חלוצית מסלולים תקנה התא.

Protocol

1. החייאת' תאים macrophage קפוא

1. לפני להחיות תאים קפואים מ -80 מעלות צלזיוס הקפאה, צריך להכין מדיום תרבות באמצעות סטרילי בינונית מסוננת השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור העובר (FBS) ו - 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​של plasmocin. Plasmocin הוא פתרון אנטיביוטי השתמשו במחקר שלנו לחסל ולמנוע זיהום mycoplasma של תרביות תאים.
2. עבור בקבוקון אחד של תאים קפואים, מוסיפים 4 מ"ל, 1 מ"ל של מדיום תרבותי ל 25 ס"מ ² בקבוק תרבית תאים במנדף Biohazard הבלימה סטרילי.
3. כאשר את הבקבוקון של תאים קפואים לקוחים במקפיא -80 מעלות צלזיוס, הם הפשירו מהר מכסה המנוע סטרילית, אשר לוקח בערך 2-3 דקות על ידי ההתחממות יד.
4. ברגע שהתאים מופשר, הם מועברים במהירות לתוך בקבוקון המכיל את המדיום מותנה בעזרת פיפטה סטרילית 1mL.
5. בקבוקון המכיל את התאים ממוקמים בתרבית רקמה החממה ב 37 ° C ו 5% CO _2.
6. תאים בדק צמיחה ועמידה על בסיס יומי עד שהם הופכים 75% עד 90% ומחוברות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.
7. במהלך הדגירה את התרבות התאים, 12 מ"מ עגול שקופיות זכוכית מעוקר ידי כיסוי אותם אתנול 70% צלחת פטרי זכוכית גדול עבור שעות 1 בממשלה הבלימה Biohazard, אלכוהול הוא הסיר לאחר מכן מאוחסן עבור reusage, והצדדים כוס רטוב נותרים חשופים תזרים סטרילי סינון האוויר בממשלה תחת UV למשך 24 שעות או עד שהם יבשים.

2. ציפוי תאים עבור Assay Sialidase

1. לפני ציפוי התאים, שקופית אחת בודדת סטרילי זכוכית עגול ממוקם היטב באחד היטב של פלקון 24-BD גם שטוחות תחתית עם מכסה רקמות תרבות צלחת קלקר שטופלו באמצעות עיקור מעוקל מלא בוערים, 4 ", משונן, נירוסטה המלקחיים . עבור בקבוק אחד של תאים בנקודת המפגש 75%, אנו משתמשים בדרך כלל 12 בארות הצלחת תרבות.
2. עבור תאים macrophage חסיד, המדיום DMEM מותנה הוסר מהבקבוק בעזרת פיפטה 5 מ"ל סטרילי בממשלה הבלימה סטרילית. לשטוף את התאים חסיד פעם עם 1x סטרילי טריס בופר סליין pH 7.4 כדי להסיר כל מדיום המכיל סרום, ולהוסיף 1 מ"ל של סידן זרחתי בינוני (CMF) חינם בופר ב-pH 7.4 מספיק כדי לכסות את התאים. התאים ממוקמים 37 ° C חממה כ -10 דקות או עד שהתאים מתחילים להמריא בבקבוק. הבקבוק ניתן התנדנדה קלות או מזועזע כדי לשחרר את כל התאים הנותרים חסיד.
3. כדי מ"ל 1 של תאים המרחפים הבקבוק, להוסיף 3 מ"ל של מדיום DMEM מותנה. קח 0.5 מ"ל של תאים על תנאי sterilely והעבירו אותם בצלחת בתרבית רקמה המכילה את 12 עגול מ"מ שקופיות הזכוכית. כ, 0.5 x 10 ⁶ תאים מועברים השקופיות זכוכית עגולה.
4. תרבות הרקמה צלחת התאים המכילים מודגרת על 37 מעלות צלזיוס 5% CO ₂ למשך 24 שעות על מנת לאפשר לתאים לדבוק שקופיות זכוכית עגולה.

3. Sialidase Assay

1. ביצוע הבקרה

1. המקום שקופיות מיקרוסקופ (חלבית: 1 סוף, 1slide, 25 x 75 x 1 מ"מ) בקבינט בלימה או ספסל מעבדה להוסיף ידי ערבוב בסדר רציף המתחמים הבאים: 1 + 1 μL DAKO μL של 4-MUNANA ולבסוף + 3 μL של טריס בופר סליין pH 7.4 (TBS).
2. לאחר הסרת התקשורת מאחד היטב המכיל את התאים, להרים בעדינות את השקף זכוכית עגול עם המלקחיים את "4 לפינה של הבאר. בזהירות להסיר את השקופית זכוכית עם המלקחיים והמקום השקופית עם התאים הפונים אל הפתרון את התערובת על השקופית מיקרוסקופ.
3. מיד לקחת את השקופית microcope כדי מיקרוסקופיה עלית פלורסנט אשר הוגדר עבור המסנן UV ויש לו מצלמה דיגיטלית ללכידת תמונות ניאון.
4. פוקוס תחת מיקרוסקופ לעומת שלב עד שתוכל לראות את התאים ולאחר מכן לעבור למצב ניאון. צלמו תמונות של התאים תחת פלורסנט בבית 1 דקות, 2 דקות, ו - 3 דקות. קחו תמונה אחת של תאים תחת בניגוד שלב.

2. ביצוע הבדיקה חיובית

1. ספוט המתחמים הבאים לפי סדר רציף בשקופית אחרת מיקרוסקופ: 1 + 1 μL DAKO μL של 4-MUNANA + 2 μL של LPS + 1 μL של TBS.
2. חזור על שלבים 3.1.2 עד 3.1.4 לעיל.

3. ביצוע הבדיקה חיובית יחד עם מעכב טמיפלו neuraminidase

1. ספוט המתחמים הבאים לפי סדר רציף הבא בשקופית אחרת מיקרוסקופ: 1μL DAKO + 1μL של 4-MUNANA + 2 μL של LPS + 1 μL של טמיפלו.
2. ריכוזים טמיפלו הם מראש שהוכנו 1x טריס בופר סליין pH 7.4, הריכוז הסופי של תרכובות במגע עם תאים חיים בשקופית זכוכית עגול יהיה גורם לדילול של 5.
3. חזור על שלבים 3.1.2 עד 3.1.4 לעיל.

4. קביעת ריכוז של מעכבי צורך לעכב 50% פעילות Sialidase (IC ₅₀₎

1. כדי לכמת את פלורסנט סביב התאים, התמונות מנותחות באמצעות ImageJ 1.38x עם תוסף לנתח את למדידת RBG. קח 50 קריאות נקודה אקראית של הקרינה המקיפה את התאים לחשב את הממוצע של הקרינה הכוללת.
2. IC ₅₀ מופק מגרש של ריכוז מעכב המרה יחידות יומן (למשל, יומן ng / mL) על ציר ה-x נגד הקרינה אומר על ציר ה-Y באמצעות רגרסיה ליניארית.

5. סודות להצלחה

1. ודא כי התאים בתרבית הם זיהום ללא mycoplasma. אנו משתמשים באופן שגרתי Plasmocin במדיום תרבות לשלוט על זה.
2. המצע neuraminidase מלאכותית, 4-MUNANA, יש להשתמש מוכן טרי. המצע מוכן ניתן להשתמש תוך שבוע עבור assay sialidase.
3. אם שורת תאים יש ביטוי נמוך קולטן על פני התא, אפשר להשתמש מינון גבוה יותר של ליגנד לגירוי.
4. יש לנו ניסיון גם כי תאי passaged במשך 6 פעמים עלול לאבד פנוטיפ הקולטן שלהם. טרי, תאים לתחייה צריך להיות תרבותי.

6. נציג תוצאות

ראה פרוטוקול אנימציה של assay sialidase עם תוצאות נציג המצורף קובץ Powerpoint .

Discussion

השימוש assay החדש שפותח כדי לזהות פעילות sialidase בתאים macrophage לחיות ^2, השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לזהות פעילות sialidase בפעילות ליגנד-Induced sialidase ב לחיות BMC-2 תאים macrophage באופן תלוי מינון, כמו גם ב לחיות DC-2.4 התאים הדנדריטים , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 תאים אדנוקרצינומה החלב, WT האדם 1140F01 ו WG0544 סוג תאים פיברובלסטים אני sialidosis. מעכבי neuraminidase כמו טמיפלו (oseltamivir פוספט) עכבות thymoquinone-Induced פעילות sialidase ב לחיות BMC-2 תאים עם ₅₀ של 0.0194 מיקרומטר IC IC לעומת ₅₀ של 19.17 מיקרומטר עבור מעכב דנה neuraminidase (2-deoxy-2 ,3-dehydro- DN-acetylneuraminic חומצה) ^5. יש לנו עוד דווח כי יישומים אחרים, כגון נוגדנים ספציפיים נגד Neu1, 3 ו -2 אין עיכוב של פעילות tq-Induced sialidase ב לחיות BMC-2 ו אדם THP-1 תאים macrophage אבל אנטי Neu4 נוגדנים לחסום לחלוטין את הפעילות הזו. ישנו יישום הפעילות sialidase לזהות פעילות נמרצת sialidase הקשורים tq שטופלו מח עצם לחיות הראשי (BM) macrophage תאים שמקורם cathepsin WT ו hypomorphic בעכברים עם חסר Neu1 משני (NeuI KD) אבל לא בנוקאאוט Neu4 ( Neu4 KO) עכברים ^1,2,5. בנוסף, הרעלן שעלת (PTX), מעכב ספציפי של חלבונים Gαi של קולטן ה-G-חלבון בשילוב (GPCR) ו מעכבי מגוון רחב של metalloproteinase מטריקס (MMP) galardin ו piperazine להחיל לחיות BMC-2, THP-1 ו העיקרי תאים BM macrophage לחסום לחלוטין tq-Induced פעילות sialidase ^5. השפעות אלו מעכבות אותו לא נצפתה עם GM1 ספציפי ganglioside רעלן הכולרה למקטע B (CTXB), כמו גם עם CTX, טירוזין קינאז מעכב K252a, והטווח הרחב GPCR מעכב suramin. מעכב ספציפי של MMP-9, אנטי MMP-9 נוגדן ואנטי נוגדן Neu4 אך לא מעכב ספציפי של MMP-3 פעילות לחלוטין tq-Induced sialidase לחסום לחיות THP-1 תאים המבטאים Neu4 ו MMP-9 על תא השטח ^5.

יחדיו, assay sialidase יכול לשמש כדי לספק תובנות רבות עוצמה המנגנונים המולקולריים של הפעלת ליגנד-Induced קולטן מעורבים sialidases כמו Neu1 או Neu4 בהתאם לאופי של ליגנד. המהירות של הפעילות ליגנד-Induced sialidase מתווכת על ידי רצפטור ליגנד הנכנס טוען כי קולטני glycosylated כמו TrkA NGF, BDNF TrkB ואת קולטני Toll-כמו צורה פרדיגמה איתות על קרום התא משטח מעורבים פלטפורמה ארגונית המולקולרי של רצפטור ליגנד הנכנס , Gαi חלבונים, MMP-9 ו Neu1 או Neu4 sialidase. מחייב ליגנד הקולטנים המתאימים גורמת פעילות sialidase דרך GPCR-איתות דרך הממברנה Gαi חלבונים MMP-9 ההפעלה. Neu1 או Neu4 ו MMP-9 לחצות לדבר מורכבת עם קולטן על פני התא מאפשר הפעלה מהירה של sialidase כדי להסיר hinderance sialic חומצה סטרית לאגודה קולטן ביצירת קולטן פונקציונלי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies
4-MUNANA	Biosynth International, Inc
Fetal calf serum	Hyclone
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media	Dako	S3023	15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)	Hoffmann-La Roche AG