Summary
唾液酸酶检测是一个简单的技术方法，将澄清新颖的TLR传感器，微生物感染和参与活巨噬细胞的细胞表面受体水平的炎症性疾病的分子机制（S）。
Abstract
哺乳动物Toll样受体（TLRs）是一种受体识别病原体相关分子模式的家庭。不仅是TLRs的关键传感器，微生物（如病毒，细菌和寄生虫）的感染，他们也发挥了重要作用，在传染病，炎症性疾病，并可能在自身免疫性疾病的病理生理。因此，对传染病的TLR反应的强度和持续时间必须严格控制。因此，了解传感器的受体，其配体的相互作用和信号元件结构的完整性是至关重要的，为后续的免疫保护。它也将提供重要的机遇，通过传感器操纵的疾病修饰。 TLR的传感器的信号通路虽然是很好的特点，控制参数仍然不明确的传感器及其配体之间的相互作用。最近，我们确定其天然配体，它过去一直没有被观察到1,2的一个新的机制激活的TLR 。这表明，配体诱导的TLR激活紧紧Neu1唾液酸酶的激活控制。我们还报道，Neu1紧紧调节神经营养因子受体TrkA的和TrkB 3，涉及Neu1和基质金属蛋白酶9（MMP - 9）与受体4复杂的串扰。唾液酸酶检测已初步找到Neu4唾液酸酶的激活的巨噬细胞，树突状细胞和成纤维细胞通过G蛋白偶联受体Gαi蛋白和MMP - 9 5的细胞表面上一种新的配体，thymoquinone，。的TLR受体，我们的数据表明，已经在复杂的Neu1唾液酸与TLR - 2，-3和-4受体，无论是受体的配体结合后引起的。激活Neu1唾液酸酶水解唾液酸α- 2 ,3 -联β-半乳糖残基配体遥远约束力删除TLR - 4的二聚体，MyD88/TLR4复杂的招聘，NFKB的激活和促炎症细胞反应的空间位阻。在一个协作的报告中，已被证明Neu1唾液酸酶，调节巨噬细胞的6细胞的吞噬功能。两者合计，唾液酸酶检测配体诱导的受体激活的分子机制提供了强大的见解。虽然Neu1唾液酸酶和激活的TLR之间的确切关系，蒂尔克受体尚未被完全阐明，这将意味着一个新的或创新性解决方案，细胞调控途径。
Protocol
1。复活冷冻的巨噬细胞
- 在复活冷冻细胞在-80 ° C冰箱，需要准备培养基使用无菌过滤贝科改良Eagle培养基（DMEM），辅以10％小牛血清（FBS）和5微克/毫升的plasmocin。 Plasmocin是一种抗生素的解决方案，在我们的研究，以消除和防止细胞培养的支原体污染。
- 一小瓶冷冻细胞，添加4毫升，1毫升培养液，在无菌生物危害防护罩一个25厘米的2细胞培养瓶中。
- 当从-80 ° C冰箱冷冻细胞小瓶，他们正在迅速解冻用手变暖，在无菌罩，这大约需要2-3分钟。
- 只要细胞解冻，他们迅速转移到包含的条件培养基的烧瓶中，使用1毫升的无菌移液器。
- 烧瓶中含有细胞被放置在一个组织文化的孵化器在37 ° C和5％的CO 2。
- 细胞增长和坚持每天检查，直到他们成为使用倒置显微镜的75％至90％汇合。
- 在细胞培养孵化，12毫米圆形玻片覆盖70％的乙醇在一个大的玻璃培养皿中的生物危害遏制柜为1小时的菜的消毒酒精后，删除和回用中，与湿玻璃两侧暴露在内阁中的无菌过滤紫外线下的空气流量为24小时或直到他们干。
2。电镀细胞的唾液酸酶检测
- 电镀前的细胞，单一无菌圆形玻片上精心放置在一个BD猎鹰24孔平底带盖组织培养处理的聚苯板，使用消毒燃烧充分弯曲，4“，呈锯齿状，不锈钢forcep 1瓶细胞75％汇合，我们通常使用12井培养板。
- 对于贴壁巨噬细胞，DMEM条件培养基使用5毫升无菌吸管瓶在无菌遏制柜中删除。洗净的贴壁细胞一旦与1X无菌三缓冲液pH为7.4，以消除任何含药血清的培养基，并添加1毫升的钙中等免费（CMF）磷酸盐缓冲生理盐水在pH值7.4，足以覆盖细胞。这些细胞放置约10分钟，或在37℃培养箱中培养，待细胞开始解除烧瓶中。烧瓶可以轻轻摇晃或动摇，放松任何剩余的贴壁细胞。
- 悬浮细胞1 ml的容量瓶中，加3毫升的DMEM条件培养基。取0.5毫升悬浮细胞和无菌他们转移到组织培养板，含有12毫米圆形玻片。约0.5 × 10 6细胞转移到圆形玻片。
- 组织培养板中含有细胞在37℃，5％的CO 2 24小时，以便为细胞坚持以圆形玻片。
3。唾液酸酶检测
1。使控制
- 将载玻片（磨砂：1月底，1slide，25 × 75 × 1毫米）在遏制柜或实验室工作台和添加顺序混合下列化合物：1μL，DAKO公司+ 1μL4 - MUNANA，最后+ 3μL的Tris缓冲液pH值7.4公司（TBS）。
- 媒体以及含有细胞取出后，轻轻提起4“forcep到井的角落的圆形玻璃幻灯片。forcep小心取出玻片上，将面临到的混合溶液对细胞的幻灯片在显微镜幻灯片。
- 随即，采取microcope幻灯片落射荧光显微镜已设置紫外线过滤器和一个数码相机捕捉荧光图像。
- 聚焦显微镜下相衬，直到你可以看到细胞，然后切换到荧光灯模式。下1分钟，2分钟，3分钟荧光细胞的照片。以单一的相衬下的细胞图片。
2。使积极的测试
- 现货另一个显微镜玻片上的顺序下列化合物：1μL，DAKO公司+ 1 4 MUNANA微升+ 2μL的LPS + 1μL的TBS。
- 重复以上步骤3.1.2至3.1.4。
3。连同神经氨酸酶抑制剂达菲制作的实证检验
- 现货另一个显微镜玻片上的下列化合物在以下顺序：1μLDAKO公司+1μL4 MUNANA + 2μL的LPS + 1μL达菲。
- 达菲浓度是事先准备好的1X的Tris缓冲盐水的pH值7.4;终浓度的圆形玻璃幻灯片的活细胞接触的化合物将有5稀释倍数。
- 重复以上步骤3.1.2至3.1.4。
4。抑制剂浓度测定需要抑制50％的唾液酸酶的活动（IC 50 ）
- 为了量化周围细胞的荧光图像分析测量的RBG的分析插件使用ImageJ 1.38x。采取随机抽查50周围细胞的荧光读数和计算的平均总荧光。
- IC 50转换为对数单位（例如，日志毫微克/毫升）对平均荧光X轴Y轴使用非线性回归的抑制剂浓度的情节产生。
5。成功的秘诀
- 确保在文化细胞支原体污染。我们经常使用在培养基Plasmocin控制。
- 人工神经氨酸酶的底物，4 MUNANA，应使用新鲜配制。准备基板可用于在一个星期内的唾液酸酶检测。
- 如果该细胞系有细胞表面上的低的受体的表达，可以使用一个较高剂量的配体为刺激。
- 我们也经历了6倍以上的传代细胞可能会失去他们的受体表型。新鲜，复活细胞应培养。
6。代表性的成果
见协议与唾液酸酶检测在所附的代表结果的动画 PowerPoint文件。
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Discussion
使用新开发的检测，检测现场的巨噬细胞的唾液酸酶的活性，我们用这种技术在现场检测唾液酸酶的活性，配体诱导的唾液酸酶的活性BMC - 2呈剂量依赖性，以及在现场的巨噬细胞的DC - 2.4树突状细胞HEK-TLR4/MD2，HEK293，SP1的乳腺腺癌细胞，人类的WT和1140F01和WG0544型我sialidosis成纤维细胞。抑制神经氨酸酶抑制剂，如达菲（奥司他韦磷酸盐）在现场thymoquinone诱导唾液酸酶的活性的IC 50的0.0194μMBMC - 2细胞相比，神经氨酸酶抑制剂德纳（2 -脱氧- 2 ,3 -脱氢酶的19.17微米的集成电路50 DN -乙酰神经氨酸）5。我们还报告说，其他应用程序，如具体的反Neu1，-2和3抗体，没有天晴诱导唾液酸酶的活性，抑制住的BMC - 2和人类的THP - 1巨噬细胞细胞，但反Neu4抗体完全阻止这一活动。唾液酸酶的活性有一个应用程序来检测一场轰轰烈烈的唾液酸酶的活性与天晴对待生活的主要骨髓（BM）会展次要Neu1缺乏症（NeuI科威特第纳尔），但不能从Neu4淘汰赛从WT和hypomorphic蛋白酶派生的巨噬细胞（ Neu4 KO）小鼠1,2,5。此外，百日咳毒素（PTX），G蛋白偶联受体（GPCR）和基质金属蛋白酶（MMP）galardin和哌嗪的广泛抑制剂Gαi蛋白的特异性抑制剂应用到生活的BMC - 2，THP - 1和初级骨髓巨噬细胞完全阻断天晴诱导唾液酸酶的活动 5 。神经节苷脂具体的霍乱毒素B亚基（CTXB）以及与CTX，酪氨酸激酶抑制剂K252a，和广泛的G蛋白偶联受体抑制剂苏拉明不遵守这些相同的抑制作用。 MMP - 9的特异性抑制剂，抗MMP - 9抗体和抗Neu4抗体，但不是特异性抑制剂MMP - 3完全阻止天晴生活唾液酸酶的活性诱导THP - 1细胞Neu4和MMP - 9表达对细胞表面的5。
两者合计，唾液酸酶测定可用于涉及取决于配体的性质，如Neu1或Neu4 sialidases的配体诱导的受体激活的分子机制提供了强大的见解。唾液酸酶的配体的约束受体介导的活性的配体诱导的速度表明，糖化受体TrkA的NGF，BDNF TrkB的Toll样受体形成细胞表面上的膜，涉及分子配体的约束受体的组织平台的信令范式Gαi蛋白，MMP - 9和Neu1或Neu4唾液酸。配体结合各自的受体诱导唾液酸通过G蛋白偶联受体信号的活动，通过膜Gαi蛋白和MMP - 9的激活。 Neu1或Neu4和MMP - 9与细胞表面上的的受体的复杂的串扰，使唾液酸酶的快速激活受体协会，以消除产生功能受体唾液酸空间位阻。
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Disclosures
SRA和PJ作为第一作者同等贡献。
Acknowledgments
刘健的赠款部分支持是从自然科学和工程研究理事会（NSERC），加拿大，哈利Botterell基金会神经科学的研究，弧，和加菲猫凯利心血管病研究和发展基金。 SRA是一个皇后大学研究奖和罗伯特J.威尔逊奖学金获得者。 PJ是女王的研究生奖和罗伯特J.威尔逊奖学金收件人。 AG和SA接受女王的研究生奖。 SF是科技（OGSST）安大略研究生奖学金的收件人。公司是皇后富兰克林蕨菜研究生奖学金的收件人。 SA是女王的RS麦克劳克林研究生奖学金获得者。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | ||
| 4-MUNANA | Biosynth International, Inc | ||
| Fetal calf serum | Hyclone | ||
| DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media | Dako | S3023 | 15 mL |
| Tamiflu (Oseltamivir Phosphate) | Hoffmann-La Roche AG |
References
- Amith, S. R. Neu1 desialylation of sialyl alpha-2,3-linked beta-galactosyl residues of TOLL-like receptor 4 is essential for receptor activation and cellular signaling. Cell Signal. 22, 314-324 (2010).
- Amith, S. R. Dependence of pathogen molecule-induced Toll-like receptor activation and cell function on Neu1 sialidase. Glycoconjugate Journal. 26, 1197-1212 (2009).
- Woronowicz, A. Dependence of neurotrophic factor activation of Trk tyrosine kinase receptors on cellular sialidase. Glycobiology. 17, 10-24 (2007).
- Jayanth, P., Amith, S. R., Gee, K., Szewczuk, M. R. Neu1 Sialidase and Matrix Metalloproteinase-9 Cross-talk is Essential for Neurotrophin Activation of Trk Receptors and Cellular Signaling. Cell. Signal. 22, 1193-1205 (2010).
- Finlay, T. M., Jayanth, P., Amith, S. R., Glimour, A., Guzzo, C., Gee, K., Beyaert, R., Szewczuk, M. R. Thymoquinone from nutraceutical black cumin oil activates Neu4 sialidase in live macrophage, dendritic, and normal and type I sialidosis human fibroblast cells via GPCR Gαi proteins and matrix metalloproteinase-9. Glycoconj J. 27, 329-348 (2010).
- Seyrantepe, V. Regulation of Phagocytosis in Macrophages by Neuraminidase 1. Journal of Biological Chemistry. 285, 206-215 (2010).
