Обнаружение Neu1 сиалидазы активность в регулировании Toll-подобных рецепторов активации

Summary

Сиалидазы анализа является простой технический подход, который позволит выяснить роман молекулярный механизм (ы) TLR датчиков микробной инфекции и участие в воспалительных заболеваний на уровне рецепторов на поверхности клетки живых макрофагов.

Abstract

Млекопитающих Toll-подобные рецепторы (TLRs) представляют собой семейство рецепторов, которые распознают патоген-связанные молекулярные паттерны. Мало того, что TLRs важно датчиков микробного (например, вирусов, бактерий и паразитов) инфекции, они также играют важную роль в патофизиологии инфекционных заболеваний, воспалительных заболеваний, и, возможно, при аутоиммунных заболеваниях. Таким образом, интенсивность и продолжительность TLR ответы с инфекционными болезнями должны быть под жестким контролем. Отсюда следует, что понимание структурной целостности датчиков-рецепторов, их взаимодействие лиганд и сигнальных компонентов имеет важное значение для последующего иммунологической защиты. Он также даст широкие возможности для модификации болезни через датчик манипуляции. Хотя сигнальные пути из TLR датчики хорошо охарактеризованы, параметры, управляющие взаимодействиями между датчиками и их лигандами до сих пор остаются плохо определены. Мы недавно выявили новый механизм активации TLR его природный лиганд, который ранее не наблюдалось ^1,2. Она предполагает, что лиганд-индуцированной активации TLR жестко контролируется Neu1 сиалидазы активации. Мы также сообщили, что Neu1 жестко регулирует нейротрофинов рецепторов, как TrkA и TrkB ^3, которые включают Neu1 и матричные металлопротеиназы-9 (MMP-9) перекрестные помехи в комплексе с рецепторами ^4. Сиалидазы анализа была изначально использовать, чтобы найти новых лигандов, тимохинон, в активации Neu4 сиалидазы на поверхности клеток макрофагов, дендритных клеток и клеток фибробластов с помощью GPCR Gαi белков и MMP-9, ^5. Для TLR рецепторы, наши данные показывают, что Neu1 сиалидазы уже в комплексе с TLR-2, -3 и -4 рецепторы, и индуцируется на связывание лигандов либо рецептора. Активированный Neu1 гидролизует сиалидазы сиалил α-2 ,3-связанных β-галактозил остатки удаленных от лиганд для удаления стерическое препятствие для TLR-4 димеризации, MyD88/TLR4 сложный набор, NFkB активации и про-воспалительных реакций клетки. В совместный доклад, Neu1 сиалидазы было показано, регулируют фагоцитоз макрофагов клетки ^6. Взятые вместе, сиалидазы анализ дает нам мощные идеи для молекулярных механизмов лиганд-индуцированной активации рецептора. Хотя точной взаимосвязи Neu1 сиалидазы и активация TLR, ТРК рецепторов до сих пор не выяснена, она будет представлять новый или новаторский подход к регуляции клеточного пути.

Protocol

1. Воскрешая замороженных клеток макрофагов

1. Прежде чем воскрешение замороженных клеток от -80 ° C морозильник, необходимо подготовить культуральной среде стерильные фильтруется Средний Дульбеко изменения Орла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 5 ​​мкг / мл plasmocin. Plasmocin является антибиотиком раствор, используемый в нашем исследовании для устранения и предотвращения загрязнения микоплазмы клеточных культур.
2. За один флакон замороженных клеток, одна добавляет 4 мл, 1 мл культурной среды на 25 см ² клеточной культуре колбу в стерильных биологической капот сдерживания.
3. Когда флакон замороженных клетках, взятых из морозильной камеры -80 ° С, они быстро талой вручную потепления в стерильных капюшон, который занимает около 2-3 мин.
4. Как только клетки размораживают, они быстро переносится в колбу, содержащую кондиционированной среды использованием 1 мл стерильной пипеткой.
5. Колбу, содержащую клетки помещаются в культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
6. Клетки проверяются на рост и соблюдение на ежедневной основе, пока они не станут от 75% до 90% сливной использованием инвертированного микроскопа.
7. Во время инкубации культуры клеток, 12 мм слайды круговой стекла стерилизуют, покрывая их в 70% этанола в большие стеклянные чашки Петри в течение 1 часа в кабинете биологической сдерживания, спирт потом снять и хранить в течение reusage и мокрой стороны стекла остаются подвержены стерильной фильтрацией воздуха в шкафу под УФ в течение 24 часов или пока они не станут сухими.

2. Покрытие Клетки для сиалидазы Пробирной

1. Перед покрытием клетки, одну стерильную круговой предметное стекло осторожно помещают в одну лунку BD Сокол 24-луночных плоскодонных с крышкой ткани культура рассматривается полистирола пластины с использованием стерилизованных пылающий полный изогнутые, 4 ", зубчатые, нержавеющая сталь forcep . С одной колбе клеток на 75% слияния, мы обычно используем 12 скважин культуры пластины.
2. Для прилипшие клетки макрофаги, DMEM кондиционированной среды удаляется из колбы с использованием 5 мл стерильной пипеткой в ​​стерильную кабинета сдерживания. Вымойте прилипшие клетки сразу с 1x стерильной Трис солевой буфер рН 7,4 для удаления сыворотки, содержащей среде, и добавьте 1 мл кальция-среде, свободной (CMF) фосфатным буферным солевым раствором при рН 7,4 достаточно, чтобы покрыть клеток. Клетки расположены в 37 ° C инкубатора в течение примерно 10 минут или пока клетки начинают отклеиваться в колбу. Колба может быть слегка потряс или потрясен, чтобы ослабить все оставшиеся прилипшие клетки.
3. Для 1 мл взвешенных клеток в колбу, добавьте 3 мл DMEM кондиционированной среды. Возьмите 0,5 мл приостановлено клеток и стерильно перевел их в ткань культурной пластины, содержащей 12 мм слайдов круговой стекла. Примерно, 0,5 х 10 ^{6 клеток} передаются на круговых слайды стекло.
4. Культуры ткани пластины, содержащей клетки инкубируют при 37 ° С в 5% CO ₂ в течение 24 часов для того, чтобы обеспечить клетки придерживаться круговой слайды стекло.

3. Сиалидазы Пробирной

1. Создание управления

1. Место стекло микроскопа (матовое: 1 конец, 1slide, 25 х 75 х 1 мм) в шкаф или сдерживания лабораторном столе и добавить путем смешивания в последовательном порядке следующие соединения: 1 мкл DAKO + 1 мкл 4-MUNANA и, наконец, + 3 мкл Трис солевой буфер рН 7,4 (TBS).
2. После снятия средств массовой информации из одной ямы содержащих клетки, слегка приподнимите круговой предметное стекло с 4 "forcep к углу хорошо. Осторожно снимите стекло с forcep и место слайд с клетками с видом на смесь раствора на предметное стекло.
3. Сразу же, возьмите microcope слайда к эпи-флуоресцентной микроскопии, который был установлен для УФ-фильтром и имеет цифровую камеру для съемки флуоресцентные изображения.
4. Фокус под микроскопом фазового контраста, пока не увидите клетки и затем переключиться на флуоресцентные режиме. Сфотографируйте клетки под флуоресцентным на 1 мин, 2 мин, 3 мин. Возьмите одну картину клетки под фазового контраста.

2. Создание положительного теста

1. Пятно следующие соединения в последовательном порядке на другую стекло микроскопа: 1 мкл DAKO + 1 мкл 4-MUNANA + 2 мкл LPS + 1 мкл TBS.
2. Повторите шаги 3.1.2 на 3.1.4 выше.

3. Создание положительного теста вместе с ингибитором нейраминидазы Тамифлю

1. Пятно следующие соединения в следующем последовательном порядке на другую стекло микроскопа: 1 мкл DAKO + 1 мкл 4-х MUNANA + 2 мкл LPS + 1 мкл Тамифлю.
2. Тамифлю концентрации заранее подготовленные в 1x Трис солевой буфер рН 7,4; конечной концентрации соединений в контакт с живыми клетками на круговой предметное стекло будет иметь коэффициент разбавления 5.
3. Повторите шаги 3.1.2 на 3.1.4 выше.

4. Определение концентрации ингибитора необходимых для блокировки 50% сиалидазы активность (IC ₅₀₎

1. Для количественной флуоресцентной окружающие клетки, изображения анализировали с помощью ImageJ 1.38x с анализа плагин для измерения RBG. Принимать по 50 случайных чтений пятно флуоресценции окружающие клетки и вычислить среднее общее флуоресценции.
2. IC _50, генерируется из участка концентрации ингибитора преобразуется как журнал единиц (например, журнал нг / мл) по оси Х от среднего флуоресценции от оси ординат использованием нелинейной регрессии.

5. Секреты успеха

1. Убедитесь, что клетки в культуре являются загрязнение свободное от микоплазм. Мы регулярно использовать Plasmocin в культуральной среде для контроля за этим.
2. Искусственного субстрата нейраминидазы, 4-MUNANA, следует использовать свежеприготовленный. Подготовленное основание может быть использовано в течение недели сиалидазы анализа.
3. Если клеточная линия имеет низкий уровень экспрессии рецептора на поверхности клеток, можно использовать более высокую дозу лиганд для стимуляции.
4. Мы также испытали, что клетки пассировали более 6 раз могут потерять свой рецептор фенотипа. Недавно, воскрес клетки должны быть культурным.

6. Представитель Результаты

Смотрите анимационный протокол сиалидазы анализа с представителем результатов в прилагаемом файле Powerpoint .

Discussion

Использование недавно разработанной метода обнаруживать сиалидазы активности в живых клетках макрофагов ^2, мы использовали эту технологию для выявления сиалидазы деятельности в индуцированной лигандом сиалидазы деятельности в живом BMC-2 макрофагов клеток в зависимости от дозы, а в живом DC-2.4 дендритных клеток , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 клетки молочной железы аденокарцинома, человека WT и 1140F01 и WG0544 типа я сиалидоз клетки фибробластов. Ингибиторы нейраминидазы, как Тамифлю (озельтамивир фосфат) тормозится тимохинон-наведенная активность сиалидазы в живых BMC-2 клеток с IC ₅₀ по 0,0194 мкМ по сравнению с IC ₅₀ из 19,17 мкМ для ингибитор нейраминидазы DANA (2-дезокси-2 ,3-дегидро- DN-ацетилнейраминовой кислоты) ^5. Мы также сообщили, что другие приложения, такие как специфические антитела анти-Neu1, -2 и 3 не имеют торможение TQ-индуцированной сиалидазы деятельности в живом BMC-2 и человеческого THP-1 клеток макрофагов, но анти-Neu4 антитела полностью заблокировать эту деятельность. Существует применение сиалидазы деятельности для выявления активной деятельности сиалидазы связанные с TQ лечение жить первичного костного мозга (КМ) макрофагов клетки, полученные из WT и hypomorphic катепсина мышей с вторичным Neu1 недостаточности (NeuI КД), но не от Neu4 нокаутом ( Neu4 KO) мышей ^1,2,5. Кроме того, коклюшного токсина (PTX), специфический ингибитор белка Gαi из G-белком рецептор (GPCR) и широкий спектр ингибиторов матриксных металлопротеиназ (ММП) galardin и пиперазина применяются жить BMC-2, THP-1 и первичные Б. М. клетки макрофагов полностью блокировать TQ-индуцированной сиалидазы деятельности ^5. Эти же ингибирующие эффекты не наблюдаются с GM1 ганглиозида конкретных субъединиц холерного токсина В (CTXB), а также с CTX, ингибитор тирозинкиназы K252a, а также широкий спектр GPCR ингибитор сурамин. Специфического ингибитора ММП-9, анти-ММП-9 антител и анти-Neu4 антител, но не специфического ингибитора ММР-3 полностью блокировать TQ-индуцированной сиалидазы деятельности в живом ТНР-1 клеток, которые экспрессируют Neu4 и ММП-9 на клеточной поверхности ^5.

Взятые вместе, сиалидазы анализа могут быть использованы для обеспечения мощной идеи для молекулярных механизмов лиганд-индуцированной активации рецептора с участием sialidases как Neu1 или Neu4 в зависимости от природы лиганда. Быстрота, индуцированной лигандом сиалидазы деятельность опосредована лиганд-рецептор связан предполагает, что гликозилированного рецепторов, как NGF TrkA, BDNF TrkB и Toll-подобные рецепторы форме сигнализации парадигмы на мембране клеточной поверхности с участием молекулярного организационную платформу лиганд-рецептор связан , Gαi белков, MMP-9 и Neu1 или Neu4 сиалидазы. Связывание лигандов соответствующих рецепторов вызывает сиалидазы деятельности через GPCR сигнализации через мембраны Gαi белков и ММП-9 активации. Neu1 или Neu4 и ММП-9 перекрестные помехи в комплексе с рецептором на поверхности клетки, позволяет быструю активацию сиалидазы для удаления сиаловой кислоты стерических препятствие к рецептору ассоциации в формировании функциональных рецепторов.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies
4-MUNANA	Biosynth International, Inc
Fetal calf serum	Hyclone
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media	Dako	S3023	15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)	Hoffmann-La Roche AG