Detectie van Neu1 Sialidase activiteit in het reguleren van Toll-like receptor activering

Summary

De sialidase test is een eenvoudige technische aanpak die nieuwe moleculaire mechanisme (s) van TLR sensoren van microbiële infecties en betrokkenheid bij inflammatoire ziekten op de receptor niveau op het celoppervlak van de live macrofagen zullen toelichten.

Abstract

Zoogdieren Toll-like receptoren (TLR's) zijn een familie van receptoren die pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen te herkennen. Niet alleen zijn TLRs cruciaal sensoren van micro-organismen (bijvoorbeeld virussen, bacteriën en parasieten) infecties, ze spelen ook een belangrijke rol in de pathofysiologie van infectieziekten, inflammatoire ziekten, en eventueel in auto-immuunziekten. Zo moeten de intensiteit en de duur van TLR responsen tegen infectieziekten goed worden gecontroleerd. Hieruit volgt dat het begrip van de structurele integriteit van sensor receptoren, hun ligand-interacties en signalering componenten essentieel is voor de volgende immunologische bescherming. Het zou ook belangrijke kansen voor de ziekte van wijziging door middel van sensor manipulatie. Hoewel de signaalwegen van TLR sensoren zijn goed gekarakteriseerd, de parameters die de interacties tussen de sensoren en hun liganden nog steeds slecht gedefinieerd. We hebben onlangs een nieuw mechanisme van TLR activering door zijn natuurlijke ligand, die nog niet eerder waargenomen ^1,2. Het suggereert dat ligand-geïnduceerde TLR activatie strak wordt gecontroleerd door Neu1 sialidase activering. We hebben ook gemeld dat Neu1 strak neurotrofine receptoren zoals TrkA en TrkB ^3, die Neu1 en matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) cross-talk in complex met de receptoren ⁴ te betrekken regelt. De sialidase test is in eerste instantie gebruiken om een nieuw ligand, thymoquinone vinden, in de activering van Neu4 sialidase op het celoppervlak van macrofagen, dendritische cellen en fibroblast cellen via GPCR Gαi eiwitten en MMP-9 ^5. Voor TLR receptoren, onze gegevens blijkt dat Neu1 sialidase al in complex met TLR-2, -3 en -4 receptoren, en wordt geïnduceerd na ligand binding aan een receptor. Geactiveerde Neu1 sialidase hydrolyseert sialyl α-2 ,3-gekoppelde β-galactosyl residuen afstand van ligand binding aan sterische hinder te verwijderen TLR-4 dimerisatie, MyD88/TLR4 complex werving en selectie, NFkB activering en pro-inflammatoire cel responsen. In een gezamenlijk rapport, is Neu1 sialidase is aangetoond dat fagocytose regelen macrofaagcellen ^6. Tezamen genomen, heeft de sialidase test heeft ons met krachtige inzichten om de moleculaire mechanismen van ligand-geïnduceerde receptor activering. Hoewel de precieze relatie tussen Neu1 sialidase en de activering van TLR, Trk receptoren is nog niet volledig opgehelderd, zou het een nieuwe of baanbrekende benadering vertegenwoordigen naar cel regelgeving paden.

Protocol

1. Resurrecting Frozen macrofaagcellen

1. Voordat wederopstanding van bevroren cellen van de -80 ° C vriezer, moet men kweekmedium met behulp van steriel gefiltreerd Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS) en 5 ug / ml plasmocin voor te bereiden. Plasmocin is een antibiotica-oplossing wordt gebruikt in het onderzoek te elimineren en te voorkomen mycoplasma besmetting van celculturen.
2. Voor een flacon van bevroren cellen, voegt men 4 ml, 1 ml van de gekweekte medium om een 25 cm ² celkweek kolf in een steriele biohazard containment kap.
3. Wanneer de flacon van bevroren cellen zijn afkomstig uit de -80 ° C vriezer, zijn ze snel ontdooid met de hand opwarming in de steriele kap, die ongeveer 2-3 minuten duurt.
4. Zodra de cellen ontdooid zijn, zijn ze snel overgebracht naar de kolf met het geconditioneerde medium met behulp van een 1 ml steriele pipet.
5. De kolf met de cellen zijn geplaatst in een weefselkweek incubator bij 37 ° C en 5% CO _2.
6. De cellen gecontroleerd op groei en hechting op een dagelijkse basis totdat ze 75% tot 90% samenvloeiing met behulp van een omgekeerde microscoop.
7. Tijdens de celkweek incubatie, 12 mm ronde glazen dia's worden gesteriliseerd door ze te bedekken in 70% ethanol in een grote glazen petrischaal gedurende 1 uur in de biologisch gevaarlijk insluiting kabinet, is de alcohol daarna verwijderd en opgeslagen voor reusage, en de natte glazen zijkanten worden overgelaten blootgesteld aan de steriel gefiltreerd luchtstroom in de kast onder een UV-voor 24 uur of tot ze droog zijn.

2. Plating Cellen voor de Sialidase Assay

1. Voordat plating de cellen, is een enkele steriele ronde glasplaatje voorzichtig in een putje van een BD Falcon 24-well vlakke bodem met deksel tissue-cultuur behandeld polystyreen plaat met behulp van een gesteriliseerd vlammend volledig gebogen, 4 ", gekarteld, roestvrij staal pincet . Voor een fles van de cellen bij 75% confluentie, gebruiken we meestal 12 putjes van de petrischaal.
2. Voor hechtende macrofaag-cellen, is de DMEM geconditioneerde medium verwijderd uit de kolf met behulp van een 5 ml steriele pipet in de steriele insluiting kabinet. Ze wast de adherente cellen met 1x steriele Tris gebufferde zoutoplossing pH 7,4 op een serum bevattend medium te verwijderen, en voeg 1 ml calcium-medium vrij (CMF) fosfaat gebufferde zoutoplossing met een pH van 7,4 genoeg is om de cellen te dekken. De cellen zijn geplaatst in de 37 ° C incubator voor ongeveer 10 minuten, of totdat de cellen beginnen te af lift in de kolf. De kolf kan voorzichtig worden gewiegd of geschud om alle resterende hechtende cellen los te maken.
3. Om de 1 ml gesuspendeerd cellen in de kolf, voeg 3 ml DMEM geconditioneerd medium. Neem 0,5 ml van de geschorste cellen en steriel overgedragen aan het weefsel gekweekte plaat met de 12 mm ronde glazen dia's. Ongeveer, zijn 0,5 x 10 ⁶ cellen overgebracht naar het ronde glazen dia's.
4. De weefselkweek plaat met cellen worden geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO ₂ voor 24 uur, zodat de cellen zich te houden aan de ronde glazen dia's.

3. Sialidase Assay

1. Het maken van de controle

1. Plaats een objectglaasje (mat: een einde, 1Schuif, 25 x 75 x 1 mm) in de insluiting kast of labtafel en voeg door het mengen in de juiste volgorde de volgende verbindingen: een pL DAKO + 1 ul van 4-MUNANA en tot slot + 3 pi van Tris gebufferde zoutoplossing pH 7,4 (TBS).
2. Na het verwijderen van de media uit een putje met de cellen, til de ronde glazen dia met de vier "pincet om de hoek van de put. Voorzichtig het glaasje te verwijderen met de pincet en plaats de dia met de cellen naar op het mengsel oplossing op het objectglaasje.
3. Onmiddellijk de microcope dia om een ​​epi-fluorescentie microscopie, die is ingesteld voor de UV-filter en heeft een digitale camera voor het vastleggen van de fluorescerende beelden.
4. Focus van de microscoop onder fasecontrast totdat u kunt zien de cellen en vervolgens overschakelen naar TL-modus. Maak foto's van de cellen onder tl-op 1 min, 2 min, en 3 minuten. Maak een foto van de cellen onder fasecontrast.

2. Het maken van de positieve test

1. Spot de volgende verbindingen in de volgorde op een andere microscoopglaasje: 1 pi DAKO + 1 ul van 4-MUNANA + 2 pi van LPS + 1 pi van TBS.
2. Herhaal de stappen 3.1.2 tot en met 3.1.4 hierboven.

3. Het maken van de positieve test, samen met neuraminidase-remmer Tamiflu

1. Spot de volgende verbindingen in de onderstaande volgorde op een ander objectglaasje: 1μL DAKO + 1μL van 4-MUNANA + 2 pi van LPS + 1 pi van Tamiflu.
2. Tamiflu concentraties zijn al voorbereid in 1x Tris gebufferde zoutoplossing pH 7,4; de uiteindelijke concentratie van de verbindingen in contact met de levende cellen op de ronde glaasje zal een verdunningsfactor van 5 hebben.
3. Herhaal de stappen 3.1.2 tot en met 3.1.4 hierboven.

4. Bepaling van de concentratie van Inhibitor die nodig is om 50% van de Sialidase Activity (IC ₅₀₎ Inhibit

1. Te kwantificeren de fluorescerende rondom de cellen, worden de beelden geanalyseerd met behulp van ImageJ 1.38x met het analyseren plugin voor het meten van RBG. Neem 50 willekeurige plek metingen van de fluorescentie rond de cellen en berekent het gemiddelde van de totale fluorescentie.
2. De IC ₅₀ is gegenereerd op basis van een plot van de inhibitor concentratie omgerekend als log-eenheden (bv., log ng / ml) op de x-as ten opzichte van de gemiddelde fluorescentie op de y-as met behulp van niet-lineaire regressie.

5. Geheimen tot succes

1. Zorg ervoor dat de cellen in cultuur zijn besmetting vrij van mycoplasma. We routinematig gebruik van Plasmocin in een kweekmedium te controleren voor deze.
2. De kunstmatige neuraminidase ondergrond, 4-MUNANA, gebruikt moet worden vers bereid. De voorbereide substraat kan worden gebruikt binnen een week voor de sialidase test.
3. Als de cel lijn heeft een lage receptor expressie op het celoppervlak, kan men een hogere dosis van het ligand te gebruiken voor stimulatie.
4. We hebben ook ervaren dat cellen gepasseerd voor meer dan 6 keer kunnen hun receptor fenotype verliezen. Vers, moet herrijzen cellen worden gekweekt.

6. Representatieve resultaten

Zie geanimeerde protocol van de sialidase test met representatieve resultaten in het bijgevoegde PowerPoint-bestand .

Discussion

Met behulp van de nieuw ontwikkelde test om sialidase te detecteren in levende macrofaagcellen ^2, hebben we gebruik gemaakt van deze technologie om sialidase activiteit te detecteren in ligand-geïnduceerde sialidase activiteit in live BMC-2 macrofaag-cellen in een dosisafhankelijke wijze zowel in live-DC-2.4 dendritische cellen , HEK-TLR4/MD2, HEK293, SP1 mammae adenocarcinoom cellen, menselijke WT en 1140F01 en WG0544 type I sialidosis fibroblast cellen. Neuraminidase-remmers zoals Tamiflu (oseltamivir fosfaat) remde thymoquinone-geïnduceerde sialidase activiteit in live BMC-2 cellen met een IC ₅₀ van 0,0194 uM in vergelijking met een IC ₅₀ van 19.17 uM voor neuraminidase-remmer DANA (2-deoxy-2 ,3-dehydro- DN-acetylneuraminezuur) ^5. We hebben ook gemeld dat andere toepassingen, zoals specifieke anti-Neu1, -2 en 3 antilichamen geen remming van TQ-geïnduceerde sialidase activiteit in live BMC-2 en menselijke THP-1 macrofaag-cellen hebben, maar anti-Neu4 antilichamen volledig te blokkeren deze activiteit. Er is een toepassing van de sialidase activiteit aan een krachtige sialidase activiteit in verband met TQ detecteren behandeld wonen primaire beenmerg (BM) macrofaag cellen, afkomstig van WT en hypomorphic cathepsine A muizen met een secundaire Neu1 deficiëntie (NeuI KD), maar niet van Neu4 knockout ( Neu4 KO) muizen ^1,2,5. Daarnaast, pertussis toxine (PTX), een specifieke remmer van Gαi eiwitten van G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) en het brede scala remmers van matrix metalloproteinase (MMP) galardin en piperazine toegepast om te leven BMC-2, THP-1 en primaire BM macrofaag-cellen volledig te blokkeren TQ-geïnduceerde sialidase activiteit ^5. Deze zelfde remmende effecten zijn niet waargenomen met de GM1 ganglioside specifieke choleratoxine subunit B (CTXB), alsook met CTX, tyrosine kinase inhibitor K252a, en het brede scala GPCR-remmer suramin. De specifieke remmer van MMP-9, anti-MMP-9 antilichaam en anti-Neu4 antilichaam, maar niet de specifieke remmer van MMP-3 volledig te blokkeren TQ-geïnduceerde sialidase activiteit in live THP-1-cellen, die Neu4 en MMP-9 te uiten over de celoppervlak ^5.

Bij elkaar genomen, kan de sialidase test gebruikt worden om krachtige visie te geven op de moleculaire mechanismen van ligand-geïnduceerde receptor activering met sialidases zoals Neu1 of Neu4 afhankelijk van de aard van het ligand. De snelheid van de ligand-geïnduceerde sialidase activiteit gemedieerd door de ligand-gebonden receptor suggereert dat geglycosyleerd-receptoren, zoals NGF TrkA, BDNF TrkB en Toll-like receptoren een signaal paradigma formulier op het celoppervlak membraan met een moleculair organisatorisch platform van ligand-gebonden receptor , Gαi eiwitten, MMP-9 en Neu1 of Neu4 sialidase. Ligand binding respectievelijke receptoren induceert sialidase activiteit door middel van GPCR-signalering via membraan Gαi eiwitten en MMP-9 activatie. Neu1 of Neu4 en MMP-9 'cross-talk in complex met de receptor op het celoppervlak maakt een snelle activering van de sialidase aan siaalzuur-sterische hinder te verwijderen receptor vereniging in het genereren van een functionele receptor.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies
4-MUNANA	Biosynth International, Inc
Fetal calf serum	Hyclone
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media	Dako	S3023	15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)	Hoffmann-La Roche AG