Détection de Neu1 activité sialidase dans la régulation activation du récepteur Toll-like

Summary

Le dosage de la sialidase est une approche simple technique qui élucidera roman mécanisme moléculaire (s) de capteurs TLR des infections microbiennes et leur implication dans les maladies inflammatoires au niveau des récepteurs à la surface cellulaire de macrophages vivre.

Abstract

Mammifères récepteurs Toll-like (TLR) sont une famille de récepteurs qui reconnaissent pathogène motifs moléculaires associés. Non seulement les TLR capteurs crucial de microbes (par exemple, virus, bactéries et parasites) des infections, mais elles jouent aussi un rôle important dans la physiopathologie des maladies infectieuses, les maladies inflammatoires et, éventuellement, dans les maladies auto-immunes. Ainsi, l'intensité et la durée des réponses TLR contre les maladies infectieuses doit être étroitement contrôlée. Il s'ensuit que la compréhension de l'intégrité structurale des récepteurs de capteurs, de leurs interactions ligand et éléments de signalisation est essentielle pour la protection immunologique ultérieure. Elle permettrait également d'importantes opportunités de modification de la maladie grâce à la manipulation du capteur. Bien que les voies de signalisation des TLR capteurs sont bien caractérisés, les paramètres contrôlant les interactions entre les capteurs et leurs ligands restent encore mal définies. Nous avons récemment identifié un nouveau mécanisme d'activation TLR par son ligand naturel, qui n'a pas été observé précédemment ^1,2. Il suggère que l'activation induite par des ligands de TLR est étroitement contrôlée par l'activation Neu1 sialidase. Nous avons également signalé que Neu1 réglemente rigoureusement les récepteurs TrkA et neurotrophine comme TrkB ^3, qui impliquent Neu1 et de la matrice métalloprotéinase-9 (MMP-9) diaphonie dans un complexe avec les récepteurs ^4. Le test a été initialement sialidase utiliser pour trouver un ligand roman, thymoquinone, dans l'activation de Neu4 sialidase à la surface cellulaire de macrophages, cellules dendritiques et des cellules de fibroblastes par l'intermédiaire des protéines GPCR Gαi et MMP-9 ^5. Pour les récepteurs TLR, nos données indiquent que Neu1 sialidase est déjà dans un complexe avec les récepteurs TLR-2, -3 et -4, et est induite lors de la liaison du ligand du récepteur soit. Activé Neu1 s'hydrolyse sialidase sialyl α-2 ,3-β-galactosyl liés résidus éloignés de liaison du ligand pour enlever encombrement stérique au TLR-4 dimérisation, MyD88/TLR4 complexes de recrutement, l'activation de NFkB et les réponses des cellules pro-inflammatoires. Dans un rapport de collaboration, sialidase Neu1 a été montré pour réglementer la phagocytose en ⁶ cellules macrophages. Pris ensemble, le dosage sialidase nous a fourni des idées puissantes pour les mécanismes moléculaires de l'activation du récepteur induite par le ligand. Bien que la relation précise entre Neu1 sialidase et l'activation des TLR, récepteurs Trk n'a pas encore été totalement élucidé, cela représenterait une nouvelle approche ou pionnière de voies de régulation cellulaire.

Protocol

1. Ressusciter les cellules macrophages congelés

1. Avant de ressusciter les cellules congelées du congélateur à -80 ° C, on a besoin pour préparer un milieu de culture stérile de l'aide moyenne filtrée Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% sérum de veau fœtal (FBS) et 5 ug / ml de plasmocin. Plasmocin est une solution antibiotique utilisé dans nos recherches pour éliminer et prévenir la contamination des mycoplasmes des cultures cellulaires.
2. Pour un flacon de cellules congelées, on ajoute 4 ml, 1 ml du milieu de culture à un 25 cm ² flacon de culture cellulaire dans une hotte de confinement stériles Biohazard.
3. Lorsque le flacon de cellules congelées sont prises dans le congélateur à -80 ° C, ils sont rapidement décongelés par le réchauffement de la main dans la hotte stérile, ce qui prend environ 2-3 min.
4. Dès que les cellules sont décongelées, elles sont rapidement transférés dans le ballon contenant le milieu conditionné aide d'une pipette de 1 ml stérile.
5. Le flacon contenant les cellules sont placées dans un incubateur de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO _2.
6. Les cellules vérifié pour la croissance et l'adhérence sur une base quotidienne jusqu'à ce qu'ils deviennent 75% à 90% de confluence en utilisant un microscope inversé.
7. Durant l'incubation de la culture cellulaire, 12 mm de verre circulaire diapositives sont stérilisés en les couvrant de 70% d'éthanol dans une boîte de Pétri grand verre pendant 1 heure dans le cabinet confinement des biorisques, l'alcool est ensuite retirée et stockée pour reusage, et les parois de verre mouillée sont laissées exposées au flux d'air stérile filtré dans l'armoire sous une lampe UV pendant 24 heures ou jusqu'à ce qu'elles soient sèches.

2. Cellules Placage pour le dosage sialidase

1. Avant de plaquer les cellules, une seule lame de verre stériles circulaire est soigneusement placé dans un puits d'une BD Falcon 24 ainsi à fond plat avec couvercle culture tissulaire plaque de polystyrène traitées en utilisant un stérilisés flamboyante pleine incurvée, 4 ", dentelé, pince en acier inoxydable . Pour un flacon de cellules à confluence de 75%, on utilise habituellement 12 puits de la plaque de culture.
2. Pour les cellules macrophages adhérents, le milieu DMEM conditionné est retiré du ballon à l'aide d'une pipette de 5 ml stériles dans l'armoire de confinement stériles. Laver les cellules adhérentes une fois avec 1x stérile tamponnée Tris pH 7,4 salines de supprimer tout milieu contenant du sérum, et ajouter 1 ml de milieu sans calcium (CMF) tampon phosphate salin à pH 7,4 suffisant pour couvrir les cellules. Les cellules sont placées dans l'incubateur 37 ° C pendant environ 10 min ou jusqu'à ce que les cellules commencent à se décoller dans le ballon. Le flacon peut être bercé ou secoué pour desserrer les cellules adhérentes restantes.
3. Pour l'mL 1 des cellules en suspension dans le flacon, ajouter 3 mL de milieu DMEM conditionné. Prenez 0,5 ml de cellules en suspension et stérilement les ont transférés à la plaque de culture de tissus contenant les 12 diapositives mm de verre circulaire. Environ, 0,5 x 10 ⁶ cellules sont transférées dans les lames de verre circulaires.
4. Les cellules de culture de tissu contenant la plaque sont incubées à 37 ° C dans 5% de CO ₂ pendant 24 heures afin de permettre aux cellules d'adhérer à la lame de verre circulaire.

3. Assay sialidase

1. Rendre le contrôle

1. Placer une lame de microscope (dépoli: 1 fin, 1slide, 25 x 75 x 1 mm) dans l'armoire de confinement ou de paillasse et ajouter en mélangeant dans l'ordre séquentiel les composés suivants: 1 ul DAKO + 1 uL de 4-Muñana et enfin + 3 ul de Tris pH tamponné salin 7.4 (SCT).
2. Après avoir enlevé les médias d'un puits contenant les cellules, soulevez doucement la lame de verre circulaire, avec les 4 "pince à l'angle du bien. Retirez délicatement la lame de verre avec la pince et placez la lame avec les cellules qui donnent sur la solution du mélange sur la la lame de microscope.
3. Immédiatement, prenez la diapositive microcope à un épi-microscopie fluorescente qui a été fixé pour le filtre UV et dispose d'un appareil photo numérique pour capturer les images fluorescentes.
4. Focus du microscope à contraste de phase sous jusqu'à ce que vous pouvez voir les cellules, puis passer en mode fluorescent. Prenez des photos de cellules fluorescentes sous à 1 min, 2 min et 3 min. Prenez une photo unique de cellules en contraste de phase.

2. Faire le test positif

1. Découvrir les composés suivants dans l'ordre séquentiel sur une autre lame de microscope: 1 ul DAKO + 1 uL de 4-Muñana + 2 ul de LPS + 1 uL de TBS.
2. Répéter les étapes 3.1.2 à 3.1.4 ci-dessus.

3. Faire le test positif avec inhibiteur de la neuraminidase Tamiflu

1. Découvrir les composés suivants dans l'ordre séquentiel suivant sur une autre lame de microscope: 1 microlitre DAKO + 1 microlitre de 4-Muñana + 2 ul de LPS + 1 uL de Tamiflu.
2. Les concentrations de Tamiflu sont pré-établi en 1x tampon Tris pH 7,4 salines; la concentration finale des composés en contact avec les cellules vivantes sur la lame de verre circulaire aura un facteur de dilution de 5.
3. Répéter les étapes 3.1.2 à 3.1.4 ci-dessus.

4. Détermination de la concentration d'inhibiteur nécessaire pour inhiber 50% de l'activité sialidase (IC ₅₀₎

1. Afin de quantifier les fluorescents entourant les cellules, les images sont analysées à l'aide ImageJ 1.38x avec le plugin d'analyser pour mesurer RBG. Prenez 50 lectures aléatoires de la fluorescence entourant les cellules et calcule la moyenne de la fluorescence totale.
2. La CI ₅₀ est générée à partir d'un tracé de la concentration de l'inhibiteur convertis en unités log (par exemple, log ng / ml) sur l'axe des x contre la moyenne de fluorescence sur l'axe Y en utilisant la régression non linéaire.

5. Les secrets du succès

1. Assurez-vous que les cellules en culture sont sans contamination par des mycoplasmes. Nous utilisons régulièrement Plasmocin dans un milieu de culture pour contrôler cela.
2. Le substrat artificiel de la neuraminidase, 4-Muñana, devrait être utilisé fraîchement préparés. Le substrat préparé peut être utilisé dans une semaine pour le dosage sialidase.
3. Si la lignée cellulaire a une faible expression des récepteurs à la surface cellulaire, on peut utiliser une dose plus élevée du ligand pour la stimulation.
4. Nous avons également constaté que les cellules repiquées depuis plus de 6 fois risquent de perdre leur phénotype du récepteur. Fraîchement, les cellules doivent être cultivées ressuscités.

6. Les résultats représentatifs

Voir le protocole d'animation de l'essai avec des résultats représentatifs sialidase joint dans le fichier Powerpoint .

Discussion

En utilisant le dosage nouvellement développée pour détecter l'activité sialidase dans les cellules macrophages vivants ^2, nous avons utilisé cette technologie pour détecter l'activité de l'activité sialidase sialidase induite par le ligand en direct BMC-2 cellules macrophages de manière dose-dépendante aussi bien en direct DC-2.4 des cellules dendritiques , HEK-TLR4/MD2, HEK293, les cellules SP1 adénocarcinomes mammaires, WT humaine et 1140F01 et WG0544 de type I des cellules de fibroblastes sialidose. Inhibiteurs de la neuraminidase comme le Tamiflu (phosphate d'oseltamivir) a inhibé thymoquinone activité induite sialidase en direct BMC-2 cellules avec un ₅₀ de 0,0194 IC uM par rapport à une CI ₅₀ de 19,17 pM pour inhibiteur de la neuraminidase DANA (2-désoxy-2 ,3-déhydro- DN-acétylneuraminique) ^5. Nous avons également signalé que d'autres applications telles que les anticorps anti-Neu1, -2 et 3 spécifiques n'ont aucune inhibition de l'activité sialidase TQ-induite en direct BMC-2 et humains THP-1 cellules macrophages, mais les anticorps anti-Neu4 bloquer complètement cette activité. Il ya une application de l'activité sialidase pour détecter une activité sialidase vigoureuse associée à TQ traités vivent moelle osseuse primaire (BM), les cellules macrophages issus de la cathepsine WT et hypomorphes Une souris avec un secondaire Neu1 carence (NeuI KD), mais pas de Neu4 KO ( Neu4 KO) ^1,2,5 souris. De plus, la toxine pertussique (PTX), un inhibiteur spécifique de protéines Gαi de récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) et les inhibiteurs de la large gamme de métalloprotéinases matricielles (MMP) et de la pipérazine galardin appliquée à vivre BMC-2, THP-1 et primaires macrophages BM bloquer complètement l'activité sialidase TQ-induite ^5. Ces mêmes effets d'inhibition ne sont pas observées avec le ganglioside GM1 B spécifiques du choléra sous-unité de toxine (CTXB) ainsi qu'avec CTX, inhibiteur de tyrosine kinase K252a, et la large plage inhibiteur de GPCR suramine. L'inhibiteur spécifique de MMP-9, anti-MMP-9 anticorps et d'anticorps anti-Neu4 mais pas l'inhibiteur spécifique de MMP-3 totalement l'activité de bloc sialidase TQ-induite en direct cellules THP-1 qui expriment Neu4 et MMP-9 sur la ⁵ surface de la cellule.

Pris ensemble, le dosage sialidase peuvent être utilisés pour fournir des indications puissant pour les mécanismes moléculaires de l'activation du récepteur induite par le ligand impliquant sialidases comme Neu1 ou Neu4 selon la nature du ligand. La rapidité de l'activité induite par le ligand sialidase médiée par le récepteur-ligand lié suggère que les récepteurs glycosylés comme NGF TrkA, le BDNF TrkB et Toll-like récepteurs forment un paradigme de signalisation sur la surface de la membrane cellulaire impliquant une plate-forme moléculaire de l'organisation d'un ligand du récepteur lié , des protéines Gαi, MMP-9 et Neu1 ou Neu4 sialidase. Liaison du ligand des récepteurs respectifs induit une activité sialidase travers RCPG-signalisation via protéines membranaires Gαi et MMP-9 d'activation. Neu1 ou Neu4 et MMP-9 diaphonie dans un complexe avec le récepteur à la surface cellulaire permet une activation rapide de la sialidase pour enlever l'acide sialique stérique entrave à l'association de récepteurs dans la génération d'un récepteur fonctionnel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies
4-MUNANA	Biosynth International, Inc
Fetal calf serum	Hyclone
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media	Dako	S3023	15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)	Hoffmann-La Roche AG