Toll様受容体の活性化を調節するのNeu1シアリダーゼ活性の検出

Summary

シアリダーゼのアッセイは、微生物感染と生マクロファージの細胞表面の受容体レベルでの炎症性疾患への関与のTLRセンサの新しい分子機構（s）を解明する簡単な技術的なアプローチです。

Abstract

哺乳類のToll様受容体（TLR）は病原体関連分子パターンを認識する受容体ファミリーです。だけでなく、TLRは微生物の重要なセンサー（例えば、ウイルス、細菌および寄生虫）感染症である、彼らはまた、おそらく自己免疫疾患で感染症、炎症性疾患、との病態生理に重要な役割を果たす。このように、感染症に対するTLR応答の強度と持続時間は厳密に管理する必要があります。それはセンサーの受容体の構造的完全性を理解すること、次の、そのリガンドの相互作用とシグナル伝達成分は、その後の免疫学的防御のために不可欠です。また、センサーの操作による疾患修飾のための重要な機会を提供するであろう。 TLRのセンサーのシグナル伝達経路はよく特徴付けされていますが、センサーとそのリガンドとの相互作用を制御するパラメータは、まだ明らかにされないままである。我々は最近、以前に^1,2を観察されていない、その天然のリガンドによるTLRの活性化の新たなメカニズムを同定した。それは、リガンド誘導TLRの活性化が密接にNeu1シアリダーゼの活性化によって制御されていることを示唆している。我々はまたNeu1がしっかりNeu1とマトリックスメタロプロテイナーゼ-9（MMP - 9）受容体⁴との複合体におけるクロストークを含むであるTrkAとTrkB ³などのニューロトロフィン受容体に、調節していることを報告している。シアリダーゼのアッセイは、最初はGPCRGαiタンパク質およびMMP - 9の^5を介してマクロファージ、樹状細胞と線維芽細胞の細胞表面上Neu4シアリダーゼの活性化で、小説リガンド、thymoquinoneを見つけるために使用されています。 TLR受容体のために、我々のデータはNeu1シアリダーゼはTLR - 2、-3および-4受容体との複合体に既に存在し、いずれかの受容体へのリガンドの結合によって誘導されることを示している。 TLR - 4量体化、MyD88/TLR4複​​雑な募集、NFkBの活性化​​および炎症誘発性細胞応答に立体障害を除去するために結合するリガンドから遠いNeu1シアリダーゼ加水分解シアリルα- 2、3 - リンクされているβ-ガラクトシル残基を活性化。共同報告書では、Neu1シアリダーゼはマクロファージの細胞⁶食作用を調節することが示されている。一緒になって、シアリダーゼのアッセイは、リガンド誘導性受容体の活性化の分子メカニズムへの強力な洞察を提供してくれました。 Neu1シアリダーゼとTLRの活性化との間の正確な関係は、TRK受容体がまだ完全に解明されているものの、それは細胞調節経路に新しいまたは先駆的なアプローチを表すことになります。

Protocol

1。復活冷凍マクロファージ細胞

1. -80℃冷凍庫から凍結細胞を復活させる前に、人は10％ウシ胎児血清（FBS）とplasmocin 5μg/ mLのを補充した滅菌濾過したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を用いて培養液を準備する必要があります。 Plasmocinは、細胞培養のマイコプラズマ汚染を排除し、防止するために私たちの研究で使用される抗生物質溶液です。
2. 凍結細胞の1バイアルの場合、一つの4mL、無菌のバイオハザード封じ込めフードで25cm ^2の細胞培養フラスコに培養液1 mLを追加します。
3. 凍結細胞のバイアルは-80℃の冷凍庫から取られている場合、それらはすぐに約2〜3分かかる滅菌フード、で手で温めることによって解凍されています。
4. とすぐに細胞が融解しているとして、彼らはすぐに1mLの滅菌ピペットを用いて馴化培地を含むフラスコに転送されます。
5. 細胞を含むフラスコを37℃、5％CO ₂で組織培養インキュベーター内に配置されています。
6. 彼らは倒立顕微鏡を用いて75〜90％コンフルエントになるまで細胞が日常的に成長し、遵守をチェック。
7. 細胞培養のインキュベーションの間に、12 mm径の円形のガラスのスライドがバイオハザード封じ込めのキャビネットで1時間に大きなガラスのペトリ皿に70％エタノールでそれらをカバーすることによって滅菌され、アルコールが、後で削除しreusageのために保管し、ウェットガラスの両側れで24時間またはそれらが乾燥しているまで、UV下キャビネットの滅菌濾過空気の流れにさらさ残されています。

2。シアリダーゼのアッセイのためのめっきセル

1. 細胞を播種する前に、一つの滅菌円形ガラススライドは慎重にBDファルコンの1つのウェルで24ウェル平底滅菌炎完全な曲線を使って蓋組織培養処理されたポリスチレンプレート、4"、鋸歯状、ステンレス鋼forcepで配置され。75％コンフルエントの細胞の1つのフラスコでは、通常、培養プレートの12ウェルを使用してください。
2. 接着マクロファージ細胞の場合は、DMEM条件培地を滅菌封じ込めのキャビネットに5 mLの滅菌ピペットを用いてフラスコから削除されます。任意の血清含有培地を除去し、カルシウム培地フリー（CMF）リン酸1 mLを追加するには、生理食塩水pH7.4をバッファ1X滅菌トリスで一度付着細胞を洗浄し、細胞をカバーするのに十分なpH7.4の緩衝食塩水。細胞がフラスコで離陸を開始するまで、細胞は約10分間または37℃のインキュベータ内に配置されています。フラスコを軽く揺り動かしたり、残りの接着細胞を緩めるために振とうすることができます。
3. フラスコ内の細胞懸濁液を1 mLに、DMEMの条件培地3 mLを加える。細胞懸濁液0.5 mLをとり、滅菌12ミリメートルの円形のガラスのスライドを含む組織培養プレートにそれらを転送する。約、0.5 × 10 ⁶細胞は円形のガラスのスライドに転送されます。
4. 細胞を含む組織培養プレートは、細胞が円形のスライドガラスに付着することができるようにするために、37℃で24時間、5％CO ₂のCでインキュベートする。

3。シアリダーゼアッセイ

1。コントロールの作成

1. 最後に、4 MUNANAの1μLDAKO + 1μLと+：顕微鏡スライド（つや消し：1終了、1slide、25 × 75 × 1mm）の置いて封じ込め、キャビネットまたはラボのベンチでをと順番に混合することにより、以下の化合物を追加します。トリスの3μLは、生理食塩水pH7.4の（TBS）をバッファ。
2. よく細胞を含むいずれかからメディアを削除した後、優しくものコーナー〜4"forcepの円形ガラススライドを持ち上げます。慎重forcepでガラススライドを削除し、上の混合溶液に直面している細胞をスライドに配置顕微鏡のスライド。
3. すぐに、UVフィルタに設定されていると蛍光画像をキャプチャするためのデジタルカメラを持っている落射蛍光顕微鏡にmicrocopeのスライドを取る。
4. もし蛍光灯モードに切り替えてセルを参照してできるようになるまで位相コントラストの下顕微鏡フォーカス。 1分、2分、3分で蛍光灯の下での細胞の写真を撮る。位相コントラスト下で細胞の単一の写真を撮る。

2。正のテストを行って

1. LPSの4 MUNANA + 2μL+ TBSの1μLの1μLDAKO + 1μL：別の顕微鏡スライド上に順番に以下の化合物を見つける。
2. 上記の手順3.1.2に3.1.4を繰り返します。

3。ノイラミニダーゼ阻害剤タミフルと一緒に正のテストを作る

1. 1μLDAKO +1μLLPSの4 MUNANA + 2μL+タミフルの1μLの：別の顕微鏡スライド上で、次の順番で以下の化合物を見つける。
2. 円形のガラススライド上に生きている細胞と接触する化合物の最終濃度が5の希釈係数を持つ、タミフルの濃度は、生理食塩水pH7.4をバッファ1Xトリスにあらかじめ用意されています。
3. 上記の手順3.1.2に3.1.4を繰り返します。

4。シアリダーゼ活性を50％抑制するのに必要な阻害剤の濃度の決定（IC _50）

1. 細胞を取り巻く蛍光を定量するために、画像がRBGを測定するための分析プラグインでImageJを1.38xを使用して分析している。細胞を取り巻く蛍光の50ランダムスポット測定値を取ると、総蛍光の平均値を計算する。
2. IC _50は、非線形回帰を用いてy軸上の平均の蛍光に対してx軸上（例えば、ログng / mL）の対数単位として変換阻害剤の濃度のプロットから生成されます。

5。成功の秘訣

1. 培養中の細胞がマイコプラズマのコンタミであることを確認してください。我々は日常的にこれを制御するための培養液中でPlasmocinを使用してください。
2. 人工的なノイラミニダーゼ基質、4 MUNANAは、作りたての使用する必要があります。調製した基質は、シアリダーゼのアッセイのための週間以内に使用することができます。
3. 細胞株は、細胞表面上の低受容体の発現がある場合、人は刺激のための配位子の高用量を使用することができます。
4. 我々はまた、6回以上にわたって継代細胞はその受容体の表現型が失われる可能性があることを経験している。たての、復活の細胞を培養する必要があります。

6。代表的な結果

添付の代表的な結果とシアリダーゼアッセイのアニメーションプロトコルを参照してください。 PowerPointファイルを 。

Discussion

ライブマクロファージ細胞²でシアリダーゼ活性を検出するために新しく開発されたアッセイを使用して、我々としても、ライブDC - 2.4樹状細胞の用量依存的にライブBMC - 2マクロファージ細胞におけるリガンド誘発性シアリダーゼ活性のシアリダーゼ活性を検出するためにこの技術を使用し、HEK-TLR4/MD2、HEK293、SP1乳腺腺癌細胞、ヒトWTおよび1140F01とWG0544 I型sialidosis線維芽細胞。タミフルなどのノイラミニダーゼ阻害剤（リン酸オセルタミビル）は、ノイラミニダーゼ阻害剤DANA（2 -デオキシ-2,3 -デヒドロ-のための19.17μMのIC ₅₀と比較して0.0194μMのIC ₅₀でライブBMC - 2細胞におけるthymoquinone誘発性シアリダーゼ活性を阻害したDN -アセチルノイラミン酸^）5。我々はまた、特定の抗Neu1、-2および3抗体などの他のアプリケーションが実稼働中BMC - 2と人間のTQ -誘導シアリダーゼ活性の阻害THP - 1マクロファージ細胞を持たないことが報告されているが、抗Neu4抗体は、完全にこの活性をブロックする。ライブ一次骨髄（BM）二次Neu1欠乏（NeuI KD）を有するマウスではなくNeu4ノックアウト（からWTとhypomorphicカテプシン由来するマクロファージ細胞を治療TQに関連付けられている精力的なシアリダーゼ活性を検出するためのシアリダーゼ活性のアプリケーションがありますNeu4 KO）マウスに^1,2,5。さらに、百日咳毒素（PTX）、G -タンパク質共役受容体（GPCR）とマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）galardinとピペラジンの広範な阻害剤のGαiタンパク質の特異的阻害剤は、THP - 1と一次、BMC - 2ライブにも適用BMのマクロファージ細胞が完全にTQ誘発性シアリダーゼ活性^5をブロックする。これらの同じ抑制効果は、GM1ガングリオシド特定のコレラ毒素サブユニットB（CTXB）だけでなく、CTXと、チロシンキナーゼ阻害剤K252a、および広範なGPCR阻害剤スラミンで観察されていません。特定のMMP - 9の阻害剤、抗MMP - 9抗体と抗Neu4抗体ではなく、ライブでのMMP - 3は完全にブロックTQ誘発性シアリダーゼ活性の特異的阻害剤THP - 1にNeu4とMMP - 9を発現する細胞細胞表面^5。

一緒になって、シアリダーゼのアッセイは、リガンドの性質に応じてNeu1またはNeu4のようなシアリダーゼが関与するリガンド誘導受容体の活性化の分子メカニズムに強力な洞察を提供するために使用することができます。リガンドが結合した受容体を介するリガンド誘発性シアリダーゼ活性の迅速性はNGFであるTrkA、BDNF TrkBをとToll様受容体のような糖鎖受容体はリガンドが結合した受容体の分子組織のプラットフォームを含む細胞表面の膜上でのシグナリングのパラダイムを形成することを示唆している、Gαiタンパク質、MMP - 9とNeu1またはNeu4シアリダーゼ。リガンド結合それぞれの受容体は膜Gαiタンパク質およびMMP - 9活性化を介してGPCRシグナリングを通じてシアリダーゼ活性を誘導する。 Neu1またはNeu4と細胞表面上の受容体との複合体におけるMMP - 9のクロストークは、機能的な受容体を生成するには受容体の関連するシアル酸-立体障害を除去するシアリダーゼの急速な活性化が可能になります。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	GIBCO, by Life Technologies
4-MUNANA	Biosynth International, Inc
Fetal calf serum	Hyclone
DakoCytomation, Fluorescent Mounting Media	Dako	S3023	15 mL
Tamiflu (Oseltamivir Phosphate)	Hoffmann-La Roche AG