注射的。 stephensi胚胎生成抗药性疟疾的蚊子

Published: July 4, 2007 doi: 10.3791/216

按蚊的蚊子是疟疾居住在印度和整个亚洲的载体。本视频演示了执行这个品种与转基因，这将赋予抵抗疟疾的蚊子microinjections技术。在此视频中演示的方法大多是适用于其他蚊种的显微注射技术。

引入外源基因的蚊子的基因组需要针对特定物种的利益显微注射技术。这个视频协议演示由詹姆斯实验室用于microinject到按蚊改造的蚊子的产生胚胎的DNA结构的方法。都说明，为准备显微注射针，收集和准备胚胎和执行显微注射技术。

在显微注射前准备：

设立被迫铺设：

收集与使用抽吸6-10血液美联储女性，他们转移到棉花和滤纸用等渗缓冲湿果蝇文化小瓶。
然后把蚊子放回在黑暗的insectery条件和奠定为1小时15分钟的鸡蛋。
让成年人飞入笼，并与胚胎取出滤纸盘。
要排队鸡蛋，根据解剖范围。鸡蛋串，并用细的画笔（紫貂，0000）收集，转移到一个3MM的Whatman纸用等渗缓冲液中浸泡的准备平方米。保持所有的时间湿纸。不要让鸡蛋得到干燥。取出用刷子exochorion，有利于更好地坚持鸡蛋到磁带。
使用罚款forcep第5号或罚款的画笔，拿起暗灰色的胚胎，并安排3MM滤纸湿用等渗缓冲平方米。线从20-30胚胎。所有胚胎必须在相同的方向，注射后极。前年底的胚胎是比后部略宽。然后，用3MM的Whatman纸的条纹，干燥过滤器内衬蛋线两侧用力挤压，不碰蛋鸡蛋。
要转移的鸡蛋，反转的幻灯片，其中包含的双面胶带（医药），并轻轻按对鸡蛋。后结束的鸡蛋都必须非常接近边缘的双面胶带。湿润的纸，这是关键的，如果是太湿，他们不会坚持。我从5-10秒的胚胎干燥，但干燥时间取决于从潮湿和显微注射室的温度。
干燥鸡蛋的关键是：有点太多和胚胎不会孵化。没有干燥的DNA是不会成胚胎。
封面，干涸的卤烃油胚胎，以防止进一步的干燥。

微量注射胚胎：

最重要的是良好的注射针的质量（见注）。

填充使用microloader（＃5242 956.003 Eppendorf公司）的DNA溶液注入一针。注射soliution很少是必要的，1〜2毫升。
连接针的Eppendorf Transjector，控制喷油时间和压力，以及背压。 × 10的放大倍率和显微（徕卡）（莱卡）在移动阶段使用显微镜进行显微注射。如果有必要，提出显微镜阶段可能准备堆放4-5显微镜幻灯片。将盖玻片上提出阶段进行胚胎。胚胎注入150 °角;渗透应在后极。注射，我把针固定和移动显微镜的阶段。当针头是新的，提示是密封的，通常在第一次注射打破。我总是工作驱逐石油在每次注射之间的DNA的小液滴所需的压力。
我注射时间为0.2 - 0.9秒和1000百帕时，针头是新的。我不同的压力和时间，直到小液滴被认为是来自针入油。背压需要100左右。由于针尖得到磨损，减少注射压力，以保持注射量低（约300百帕）。在此之后，针头过大，是杀死大部分的胚胎。
注射后，取出用纸巾石油和盖用等渗缓冲液的培养皿中的胚胎和地方的幻灯片。放置在insectory的菜肴，让他们那里，直到胚胎孵化。他们开始孵化后2-6天。幼虫转移到蒸馏水中，与地面鱼类食品的捏。

注释

使用EndoFree质粒套件的DNA注射 ：注射质粒DNA溶液分离。构建质粒和辅助质粒正确的浓度混合，用异丙醇沉淀。在注射缓冲区resuspending前用70％乙醇洗涤沉淀。注射前，干净的DNA使用Millex - GV列。

Izotonic缓冲区：

1.68 M氯化钠 - 88.3毫升

1.68 M氯化钠 - 2.9米

1 M羟乙基-10.7毫升

1.12米氯化钙₂ - 2.2毫升

DH _{2 O} - 896毫升

或

5 M氯化钠 - 29.67毫升

1个M氯化钾 - 4.87毫升

1 M羟乙基 - 10.7毫升

1.12米氯化钙₂ - 2.2毫升

DH _{2 O} - 952.56毫升

调整pH至7.2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Injection Quartz needles		Sutter Instrument Co.		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Qiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification