Summary
Anopheles stephensi myggor är vektorer för malaria lever Indien och hela Asien. Denna video visar en teknik för att utföra microinjections av denna art med transgener som ger resistens mot malaria till mygga. Mycket av de metoder som visat i den här videon är tillämplig på mikroinjektion tekniker av andra myggarter.
Abstract
Införandet av exogena gener i kartläggningen av myggor kräver mikroinjektion tekniker anpassade till specifika arter av intresse. Denna video protokoll visar en metod som James laboratoriet för att microinject DNA-konstruktioner i Anopheles stephensi embryon för generering av förvandlade myggor. Tekniker för att förbereda mikroinjektion nålar, samla in och förbereda embryon och utföra mikroinjektion illustreras.
Protocol
Preparat i förväg mikroinjektion:
- Blod foder myggor: för injektion från måndag till onsdag mata honorna på föregående fredag. Att injicera torsdag och fredag, foder honor på måndagen i samma vecka.
- Förbered Quartz nålar med hjälp av programmet 2 och isoton buffert (se material).
- "Att lägga röret" för embryon är den vanliga Drosophila kulturen flaskan. Blöt bomull i botten, med en våt disk av filtrerpapper som täcker det.
- Förbered plasthölje slinka genom att sticka dubbelsidig tejp på ena änden. Trimma tejp för att täcka glida så att den slutar vid kanten av locket halka.
- Förbered olja för uttorkning.
- Förbered en petriskål med isoton buffert för att överföra embryon för kläckning.
Sätt upp av tvångsarbete om:
- Samla 6-10 blod matas honor med hjälp av en aspirator och överföra dem till Drosophila kultur flaskan med bomull och filterpapper blöta med isoton buffert.
- Myggorna är sedan lägga tillbaka i insectery villkor i mörkret och tillåtas att lägga ägg i 1 h och 15 min.
- Låt vuxna flyga in i buren och ta bort filtret papper disken med embryon.
- Att rada upp ägg, gör det under dissekera omfattning. Samla klasar av ägg med en fin pensel (Sable, nr 0000) och överför till en förberedd torget 3MM Whatman papper indränkt med isoton buffert. Hålla papperet hela tiden våt. Låt inte äggen komma uttorkad. Ta bort exochorion med penseln, det hjälper att bättre hålla ägg till bandet.
- Använda fina forcep nr 5 eller ett fint pensel, plocka upp mörkare grå embryon och ordna i rad på torget i 3MM Whatman våta med isoton buffert. Rada upp från 20 till 30 embryon. Alla embryon måste vara i samma riktning som injektion måste vid bakre stolpen. Den främre änden av embryon är något bredare än den bakre. Använd sedan ränder av 3mm Whatman papper, torka filtret där äggen är uppradade genom att trycka hårt på båda sidorna av ägget linjen inte vidrör äggen.
- För att överföra äggen, invertera bilden innehåller dubbelhäftande tejp (medicin), och tryck försiktigt mot ägg. Den bakre änden av äggen måste vara mycket nära kanten av dubbelhäftande tejp. Den väta av papper är avgörande för detta, om det är för blött att de inte fastnar. Jag uttorkning av embryon från 5 till 10 sekund, men uttorkning beror av fuktighet och temperatur i mikroinjektion rum.
- Uttorkning är avgörande för ägg: lite för mycket och embryon som inte kommer att kläckas. Utan uttorkning DNA inte gå in embryot.
- Täck uttorkad embryon med Halocarbon olja för att förhindra ytterligare uttorkning.
Mikroinjektion av embryona:
Den viktigaste aspekten av god injektion är kvaliteten på nålen (se not).
- Fyll en nål med DNA-lösning som skall injiceras med hjälp av en microloader (Eppendorf # 5242 956,003). Mycket lite injektion soliution behövs, 1 till 2 ml.
- Anslut nålen till Eppendorf Transjector, som styr injektion tid och tryck, samt mottryck. Mikroinjektion utförs med ett mikroskop med en rörlig fas (Leica) vid x 10 förstoring och mikromanipulator (Leica). Vid behov kan en upphöjd mikroskop skede vara förberedd genom att stapla 4-5 objektglas. Placera locket glida bär embryon på upp scenen. Embryon injiceras på en 150 ° vinkel, penetrationen bör vara på den bakre stolpen. För injektion, håller jag nålen stationära och flytta skede av mikroskop. När nålen är ny, är toppen förseglas och oftast avbrott i den första injektionen. Jag arbetar alltid ut trycket som behövs för att driva ut en liten droppe av DNA till olja mellan varje injektion.
- Jag sätter injektionen tid till 0,2 till 0,9 sek och 1000 hPa när nålen är ny. Jag varierar trycket och tiden tills en liten droppe syns kommer ut från nålen i oljan. Den mottryck måste ställas in omkring 100. Som nålspetsen blir slitna, har insprutningstryck minskas för att hålla låga injektionsvolym (ca 300 hPa). Efter detta är nålspetsen för stor och dödar de flesta embryona.
- Efter injektion, ta bort oljan med silkespapper och täcka bilden med embryon och plats i petriskål med isoton buffert. Placera disken i insectory och lämna dem där tills embryona kläcks. De börjar kläcks efter 2-6 dagar. Överför larverna att destillerat vatten med nypa marken fiskfoder.
Anteckningar
DNA för injektion: Plasmid DNA injektionsvätska var isolerad med EndoFree plasmiden kit.Konstruera plasmid och Helper plasmid blanda i rätt koncentration, fälls ut med isopropanol. Pelleten tvättades med 70% etanol innan resuspending i injektion buffert. Före injektionen rengör DNA med Millex-GV kolumn.
Izotonic buffert:
| 1,68 M NaCl - 88,3 ml 1,68 M NaCl - 2,9 m 1 M Hepes -10,7 ml 1,12 M CaCl 2 till 2,2 ml dH 2 O - 896 ml | ELLER | 5 M NaCl - 29,67 ml 1 M KCl - 4,87 ml 1 M Hepes - 10,7 ml 1,12 M CaCl 2 till 2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml |
Justera till ph 7,2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection Quartz needles | Sutter Instrument Co. | O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller. | ||
| Quartz puller | Tool | Sutter Instrument Co. | P-2000 | Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| EndoFree plasmid kit | Qiagen | |||
| Isopropanol | ||||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | for DNA cleaning | ||
| Construct DNA | 0.5 mg/ml | |||
| Helper plasmid | 0.3 mg/ml | |||
| Injection solution | Buffer | 1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Isotonic buffer | see recipe in the protocol section | |||
| Dessication oil | Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection. | |||
| Blood | to feed mosquitos | |||
| Anopheles stephensi | Animal | Mosquitos, male and female. | ||
| Drosophila culture vial | for egg laying | |||
| Petri dishes | with isotonic buffer, for embryo hatching | |||
| Fine paintbrush | Sable # 0000 | |||
| 3MM Whatman paper | ||||
| Forceps #5 | ||||
| double sided tape | ||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Transjector | Eppendorf | |||
| Microscope | Leica Microsystems | with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification |
