Summary
אנופלס יתושים stephensi הם וקטורים עבור מלריה בהודו המאכלסים וברחבי אסיה. וידאו זה מדגים את הטכניקה לביצוע microinjections של מין זה עם transgenes כי יעניק התנגדות מלריה אל היתוש. הרבה המתודולוגיה הפגינו וידאו זה הוא ישים טכניקות microinjection של מינים יתושים אחרים.
Abstract
המבוא של גנים חיצוניים לתוך הגנום של יתושים דורש טכניקות microinjection המותאמים למין ספציפי של עניין. זה פרוטוקול וידאו מדגים שיטה המשמשת את המעבדה ג'יימס microinject בונה DNA לעוברי אנופלס stephensi עבור הדור של יתושים טרנספורמציה. טכניקות להכנת מחטים microinjection, איסוף והכנת עוברי וביצוע microinjection מומחשים.
Protocol
הכנה מראש של microinjection:
- להאכיל יתושים דם: להזרקה מיום שני עד יום רביעי נקבות להאכיל ביום שישי הקודם. כדי להזריק חמישי ושישי, נקבות להאכיל ביום שני של אותו שבוע.
- הכינו את המחטים קוורץ באמצעות תוכנית 2 ו חיץ איזוטוני (ראה חומרים).
- "הנחת צינור" עבור עוברי הוא בקבוקון תרבות רגיל תסיסנית. צמר גפן רטוב בתחתית, עם דיסק רטוב נייר לסנן מכסה אותו.
- הכן להחליק כיסוי הפלסטיק על ידי דבק פעמיים בצד קלטת בקצה אחד. קלטת Trim כדי לכסות להחליק כך מסתיים בקצה של פליטת לכסות.
- הכנת שמן התייבשות.
- הכינו צלחת פטרי עם חיץ איזוטוני להעביר עוברים הבקיעה.
הגדרת הנחת בכפייה:
- איסוף דם 6-10 נקבות נמאס עם השימוש aspirator ולהעבירם בקבוקון התרבות תסיסנית עם צמר גפן רטוב עם נייר סינון חיץ איזוטוני.
- יתושים הם ואז לשים בחזרה התנאים insectery בחושך מותר להטיל ביצים עבור 1 שעות ו 15 דקות.
- בואו מבוגרים לטוס לתוך הכלוב ולהוציא את הדיסק עם נייר סינון עוברים.
- בשורה ביצים, לעשות את זה מתחת למשטח הביתור. איסוף צרורות של ביצים עם מכחול דק (סייבל, לא 0000) ולהעביר לכיכר מוכן נייר Whatman 3mm ספוגה חיץ איזוטוני. שמור על נייר כל הזמן רטוב. אל תתנו ביצים לקבל מיובש. הסר את exochorion עם מברשת, זה עוזר יותר מקל ביצים לקלטת.
- שימוש בסדר המלקחיים מס '5 או במכחול דק, להרים עוברים אפור כהה יותר לארגן בשורה בכיכר של Whatman 3mm רטוב עם חיץ איזוטוני. הקו עד 20-30 עוברים. עוברים כל חייב להיות בכיוון זהה הזרקה יש בקוטב האחורי. סוף הקדמי של עוברים הוא קצת יותר מאשר האחורי. לאחר מכן, באמצעות פסים של נייר Whatman 3mm, לייבש את המסנן שבו ביצים מסודרים על ידי לחיצה קשה משני צידי הקו ביצה, לא נוגע את הביצים.
- כדי להעביר את הביצים, להפוך את השקופית המכילה את סרט דו צדדי (רפואה), ולחץ בעדינות על הביצים. סוף האחורי של הביצים חייב להיות קרוב מאוד לקצה של הקלטת דו צדדי. הרטיבות של העיתון הוא קריטי זה, אם הוא רטוב מדי הם לא מקל. אני עושה את התייבשות של העוברים בין שניה 5-10, אבל הפעם התייבשות תלוי מן ולח והטמפרטורה בחדר microinjection.
- התייבשות היא קריטית עבור ביצים: קצת יותר מדי עוברי לא יבקעו. ללא ה-DNA יובש לא הולך לעובר.
- כיסוי עוברים מיובש עם שמן halocarbon כדי למנוע התייבשות נוספת.
Microinjection של העוברים:
ההיבט החשוב ביותר של זריקה טובה הוא איכות המחט (ראה הערה).
- מלא מחט עם פתרון ה-DNA להיות מוזרק באמצעות microloader (Eppendorf # 5242 956.003). מאוד soliution הזרקה קטן יש צורך, 1-2 מ"ל.
- חבר את המחט אל Transjector Eppendorf, השולטת זמן הזרקה בלחץ, כמו גם את backpressure. Microinjection מבוצע באמצעות מיקרוסקופ עם הבמה נע (לייקה) בהגדלה של 10 x ו micromanipulator (לייקה). אם יש צורך, בשלב מיקרוסקופ העלתה עשוי להיות מוכן על ידי הערמה שקופיות מיקרוסקופ 4-5. מניחים את תלוש לכסות נושאת את העוברים על הבמה המוגבהת. עוברים מוזרקים בזווית 150 °; חדירה צריך להיות בקוטב האחורי. עבור זריקה, אני ממשיך המחט נייחים להזיז את הבמה של המיקרוסקופ. כאשר המחט חדשה, קצה אטום ובדרך כלל הפסקות הזריקה הראשונה. אני תמיד לחשב את הלחץ הדרוש כדי לגרש טיפה קטנה של דנ"א לתוך השמן בין כל הזרקה.
- אני קובע את זמן ההזרקה כדי 0.2-0.9 שניות ו 1000 hPa כאשר המחט חדשה. אני להשתנות את הלחץ ואת הזמן עד טיפה קטנה נראה יוצא מן המחט לתוך השמן. Backpressure צריך להיות מוגדר סביב 100. כאשר קצה המחט מקבל שחוקים, הלחץ הזרקת צריך להיות מופחת כדי לשמור על נפח הזרקה נמוך (כ 300 hPa). אחרי זה, קצה המחט גדולה מדי, והוא הורג את מרבית העוברים.
- לאחר ההזרקה, להסיר את השמן עם נייר ומכסים את השקופית עם עוברי ומניחים בצלחת פטרי עם חיץ איזוטוני. מניחים את הכלים insectory ולהשאיר אותם שם עד עוברים את הפתח. הם מתחילים לבקוע לאחר 2-6 ימים. מעבירים את הזחלים למים מזוקקים עם קמצוץ של מזון דגים הקרקע.
הערות
ה-DNA להזרקה: פתרון ה-DNA פלסמיד להזרקה היה מבודד באמצעות ערכת פלסמיד EndoFree.Construct פלסמיד ומערבבים Helper פלסמיד יחד בריכוז הנכון, זירז עם isopropanol. גלולה נשטף עם אתנול 70% לפני resuspending במאגר ההזרקה. לפני הזריקה, DNA נקי באמצעות Millex-GV העמודה.
Izotonic חיץ:
| 1.68 M NaCl - 88.3 מ"ל 1.68 M NaCl - 2.9 מ ' 1 M Hepes -10.7 מ"ל M 1.12 CaCl 2-2.2 מ"ל DH 2 O - 896 מ"ל | או | 5 M NaCl - 29.67 מ"ל 1 M KCl - 4.87 מ"ל 1 M Hepes - 10.7 מ"ל M 1.12 CaCl 2-2.2 מ"ל DH 2 O - 952.56 מ"ל |
התאם ל-pH 7.2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection Quartz needles | Sutter Instrument Co. | O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller. | ||
| Quartz puller | Tool | Sutter Instrument Co. | P-2000 | Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| EndoFree plasmid kit | Qiagen | |||
| Isopropanol | ||||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | for DNA cleaning | ||
| Construct DNA | 0.5 mg/ml | |||
| Helper plasmid | 0.3 mg/ml | |||
| Injection solution | Buffer | 1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Isotonic buffer | see recipe in the protocol section | |||
| Dessication oil | Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection. | |||
| Blood | to feed mosquitos | |||
| Anopheles stephensi | Animal | Mosquitos, male and female. | ||
| Drosophila culture vial | for egg laying | |||
| Petri dishes | with isotonic buffer, for embryo hatching | |||
| Fine paintbrush | Sable # 0000 | |||
| 3MM Whatman paper | ||||
| Forceps #5 | ||||
| double sided tape | ||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Transjector | Eppendorf | |||
| Microscope | Leica Microsystems | with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification |
