Injectie van An. stephensi Embryo's aan Malaria-resistente muggen Generate

Summary

Anopheles stephensi muggen zijn vectoren voor malaria wonen India en de rest van Azië. Deze video toont de techniek voor het uitvoeren van micro-injecties van deze soorten met transgenen die weerstand zal verlenen aan de malaria aan de mug. Een groot deel van de methodologie kunnen zien in deze video is van toepassing op micro-injectie technieken van andere muggensoorten.

Abstract

De introductie van exogene genen in het genoom van muggen nodig micro-injectie technieken afgestemd op de specifieke soorten van belang. Deze video toont een protocol methode die wordt gebruikt door de James laboratorium DNA-constructen microinject in Anopheles stephensi embryo's voor het genereren van getransformeerde muggen. Technieken voor het bereiden van micro-injectie naalden, het verzamelen en het voorbereiden van embryo's en het uitvoeren van de micro-injectie worden geïllustreerd.

Protocol

Voorbereiding van de micro-injectie:

1. Bloed te voeden muggen: voor injectie van maandag tot en met woensdag voeden vrouwen op de vorige vrijdag. Tot en met donderdag en vrijdag, voeden vrouwen injecteren op maandag van dezelfde week.
   
   
2. Bereid de Quartz naalden met behulp van programma 2 en isotone buffer (zie ook Materiaal).
   
   
3. "Het leggen tube" voor de embryo's is de reguliere Drosophila cultuur flacon. Natte watten in de bodem, met een natte schijf van filtreerpapier te bedekken.
   
   
4. Bereid plastic dekglas door steken dubbelzijdig tape om het ene uiteinde. Trim tape om dekglas, zodat het eindigt aan de rand van het dekglas.
   
   
5. Bereid olie voor uitdroging.
   
   
6. Bereid een petrischaal met een isotone buffer om embryo transfer voor het uitkomen.

Opzetten van gedwongen leggen:

1. Verzamel 60-10 bloed gevoed vrouwtjes met het gebruik van een afzuiger en overbrengen naar het Drosophila cultuur flacon met katoen en filtreerpapier nat met een isotone buffer.
   
   
2. De muggen worden vervolgens weer in insectery omstandigheden in het donker en toegestaan ​​om eieren gedurende 1 uur en 15 minuten te leggen.
   
   
3. Laat volwassenen vliegen in de kooi en verwijder het filter papier schijf met embryo's.
   
   
4. Om line-up eieren, doe het dan onder de reikwijdte ontleden. Verzamel bossen van eieren met een fijn penseel (Sable, No 0000) en over te dragen aan een voorbereide vierkant van 3MM Whatman papier doorweekt met isotone buffer. Houd papier alle tijd nat. Laat geen eieren te krijgen uitgedroogd. Verwijder de exochorion met de borstel, het helpt om beter eieren houden aan de tape.
   
   
5. Met behulp van fijne pincet nr. 5 of een geldboete penseel, pick-up donkerder grijs embryo's en schik in lijn op plein van 3MM Whatman nat met een isotone buffer. Line-up 20 tot 30 embryo's. Alle embryo's moeten in dezelfde richting als injectie moet worden bij posterior pole. Het voorste einde van de embryo's is iets breder dan de achterste. Dan, met strepen van 3MM Whatman papier, droog het filter waar de eieren zijn tot omzoomd door hard aan beide zijden van het ei lijn, niet aanraken van de eieren.
   
   
6. Voor de overdracht van de eieren, Keer de schuif met de dubbelzijdige tape (Geneeskunde), en druk voorzichtig op ten opzichte van de eieren. Het achterste einde van de eieren moeten heel dicht bij de rand van de dubbelzijdige tape. De natheid van het papier is van cruciaal belang voor deze, als het te nat is zullen ze niet plakken. Ik uitdrogen van de embryo's 5 tot 10 seconden, maar verdroging is afhankelijk van vochtig en de temperatuur in de micro-injectie ruimte.
   
   
7. Verdroging is cruciaal voor de eieren: beetje te veel en embryo's zal uitkomen niet. Zonder uitdroging DNA is niet in te gaan op embryo.
   
   
8. Bedek gedroogde embryo's met halogene olie om verdere uitdroging te voorkomen.

Micro-injectie van de embryo's:

Het belangrijkste aspect van een goede injectie is de kwaliteit van de naald (zie opmerking).

1. Vul een naald met de DNA-oplossing te worden geïnjecteerd met behulp van een microloader (Eppendorf # 5242 956.003). Zeer weinig injectie soliution is nodig, 1 tot 2 ml.
   
   
2. Sluit de naald naar de Eppendorf Transjector, die de injectie tijd en de pressostaten, evenals de tegendruk. Micro-injectie wordt uitgevoerd met behulp van een microscoop met een bewegend podium (Leica) op 10 x vergroting en micromanipulator (Leica). Indien nodig kan een verhoogd microscoop stadium worden voorbereid door het stapelen 4-5 microscoop dia's. Plaats het deksel slip dragen van de embryo's op verhoogd podium. Embryo's zijn geïnjecteerd met een 150 ° hoek; penetratie moet op de achterste paal. Voor injectie, ik houd de naald stil en verplaats het stadium van de microscoop. Wanneer de naald nieuw is, is de tip afgesloten en meestal breuken in de eerste injectie. Ik werk altijd de druk die nodig is om een ​​klein druppeltje van het DNA te verdrijven in de olie tussen elke injectie.
   
   
3. Ik de injectie tijd om 0,2 tot 0,9 sec en 1000 hPa wanneer de naald is nieuw. Ik varieer de druk en de tijd totdat er een klein druppeltje wordt gezien coming out van de naald in de olie. De tegendruk moet worden ingesteld rond de 100. Als de naald wordt gedragen, de inspuitdruk moet worden teruggebracht tot de injectie volume laag (ongeveer 300 hPa) te houden. Na deze, de naald is te groot en is het doden van het merendeel van de de embryo's.
   
   
4. Na injectie, verwijder de olie met zijdepapier en dekking van de dia met embryo's en plaats in de petrischaal met een isotone buffer. Plaats de gerechten in de insectory en laat ze daar totdat de embryo's uitkomen. Ze beginnen te komen na 2-6 dagen. Breng de larven om gedestilleerd water met het mespuntje gemalen visvoer.

Opmerkingen

DNA voor injectie: Plasmide DNA-oplossing voor injectie werd geïsoleerd met behulp van EndoFree plasmide kit.Plasmideconstruct en Helper plasmide mengen in de juiste concentratie, geprecipiteerd met isopropanol. De pellet werd gewassen met 70% ethanol voor resuspenderen in injectie buffer. Vóór injectie schoon met behulp van DNA Millex-GV kolom.

Izotonic buffer:

1,68 M NaCl - 88,3 ml 1,68 M NaCl - 2,9 m 1 M Hepes -10,7 ml 1,12 M CaCl 2 tot 2,2 ml dH 2 O - 896 ml

OR

5 M NaCl - 29.67 ml 1 M KCl - 4,87 ml 1 M Hepes - 10,7 ml 1,12 M CaCl 2 tot 2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml

Aan te passen aan de pH 7,2

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Injection Quartz needles		Sutter Instrument Co.		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Qiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification