La inyección de una. Los embriones stephensi para generar la malaria resistente a los mosquitos

Summary

Los mosquitos Anopheles stephensi son vectores de la malaria que habitan en la India y en toda Asia. Este video muestra la técnica para la realización de micro-inyecciones de esta especie con transgenes que confieren resistencia a la malaria a los mosquitos. Gran parte de la metodología se demuestra en este vídeo es aplicable a las técnicas de microinyección de otras especies de mosquitos.

Abstract

La introducción de genes exógenos en los genomas de los mosquitos requiere técnicas de microinyección adaptados a las especies de interés. Este protocolo de vídeo se muestra un método utilizado por el laboratorio de James microinject construcciones de ADN en embriones Anopheles stephensi para la generación de mosquitos transformado. Técnicas para la preparación de las agujas de microinyección, recolección y preparación de los embriones y la realización de la microinyección se ilustran.

Protocol

Preparación antes de la microinyección:

1. Los mosquitos la sangre de alimentación: para la inyección de lunes a miércoles en hembras se alimentan del viernes anterior. Para inyectar el jueves y viernes, las hembras se alimentan de lunes de la misma semana.
   
   
2. Prepare las agujas de cuarzo, utilizando el programa 2 y tampón isotónico (ver Materiales).
   
   
3. "Colocación de tubo" de los embriones es la normal vial Drosophila cultura. Algodón húmedo en la parte inferior, con un disco de papel de filtro húmedo que lo cubre.
   
   
4. Prepare cubreobjetos de plástico adhesiva de doble cara de la cinta a un extremo. Cinta de ajuste para cubrir deslizamiento de forma que termine en el borde del cubreobjetos.
   
   
5. Preparar el aceite para la desecación.
   
   
6. Prepare una placa de Petri con tampón isotónica para la transferencia de embriones para incubar.

Puesta en marcha de por la que se obligó:

1. Recoger 60-10 hembras alimentadas con sangre con el uso de un aspirador y transferirlos a la cultura vial Drosophila con algodón y papel de filtro húmedo con tampón isotónico.
   
   
2. Los mosquitos son puestos de nuevo en condiciones insectery en la oscuridad y se les permite poner sus huevos durante 1 hora y 15 minutos.
   
   
3. Permiten a los adultos vuelan en la jaula y retire el disco de papel filtro con embriones.
   
   
4. Para alinear los huevos, lo hacen bajo el microscopio de disección. Recoger los racimos de huevos con un pincel fino (Sable, No 0000) y traslado a una plaza preparada de papel Whatman 3MM empapado en tampón isotónico. Mantenga el papel todo el tiempo húmedo. No permitas que los huevos se desecado. Retire la exochorion con el cepillo, que ayuda a pegar mejor los huevos en la cinta.
   
   
5. El uso de fórceps fino N º 5 o un pincel fino, recoger más oscuro embriones gris y arreglos en línea en la plaza de Whatman 3MM humedecido con tampón isotónico. Línea hasta 20 a 30 embriones. Todos los embriones debe estar en la misma orientación que la inyección tiene que ser en el polo posterior. El extremo anterior de los embriones es ligeramente más ancha que la posterior. Luego, utilizando tiras de papel Whatman 3MM, secar el filtro donde los huevos están alineados al presionar con fuerza a ambos lados de la línea de huevo, sin tocar los huevos.
   
   
6. Para transferir los huevos, invertir la diapositiva que contiene la cinta de doble cara (Medicina), y presione suavemente contra los huevos. El extremo posterior de los huevos tienen que estar muy cerca de la orilla de la cinta de doble cara. La humedad del papel es fundamental para esto, si es demasiado húmedo no se peguen. Yo hago la desecación de los embriones de 5-10 segundos, pero el tiempo depende de la desecación de humedad y temperatura en la sala de microinyección.
   
   
7. La desecación es crucial para los huevos: poco demasiado y embriones no van a eclosionar. Sin un ADN desecación no va a embrión.
   
   
8. Cubrir los embriones desecados con aceite para evitar la desecación de halocarbonos más.

Microinyección de los embriones:

El aspecto más importante de la inyección es la calidad de la aguja (ver nota).

1. Llenará una aguja con la solución de ADN que se inyecta mediante una microloader (Eppendorf # 5242 956.003). Soliution muy pequeña inyección es necesaria, de 1 a 2 ml.
   
   
2. Conecte la aguja a la Transjector Eppendorf, que controla el tiempo de inyección y la presión, así como la contrapresión. Microinyección se realizó con un microscopio con una etapa de movimiento (Leica) en x 10 aumentos y un micromanipulador (Leica). Si es necesario, una platina del microscopio planteado puede ser preparado por el apilamiento de diapositivas 4-5 microscopio. Coloque la hoja de la cubierta lleva los embriones en etapa levantada. Los embriones se inyectan en un ángulo de 150 °, la penetración debe ser en el polo posterior. Para la inyección, que mantener la aguja fija y mover la platina del microscopio. Cuando la aguja es nueva, la punta está sellada y generalmente se rompe en la primera inyección. Yo siempre trabajo con la presión necesaria para expulsar a una pequeña gota de ADN en el aceite entre cada inyección.
   
   
3. Me puse el tiempo de inyección de 0,2 a 0,9 seg y 1000 hPa, cuando la aguja es nueva. Puedo variar la presión y el tiempo hasta que una pequeña gota se ve que sale de la aguja en el aceite. La contrapresión es necesario establecer alrededor de 100. A medida que la punta de la aguja se desgasta, la presión de inyección se debe reducir para mantener al mínimo el volumen de la inyección (cerca de 300 hPa). Después de esto, la punta de la aguja es demasiado grande y está matando a la mayoría de los embriones.
   
   
4. Después de la inyección, extraer el aceite con papel de seda y cubierta de la diapositiva con embriones y el lugar de la placa de Petri con tampón isotónico. Colocar las cápsulas en el insectory y los dejan allí hasta que los embriones eclosionan. Comienzan a nacer después de 2-6 días. Transferencia de las larvas al agua destilada con la pizca de comida de peces de fondo.

Notas

ADN para la inyección: solución de ADN plásmido para la inyección fue aislado utilizando el kit plásmido EndoFree.Construir el plásmido y la mezcla de plásmido ayudante juntos en la concentración de la derecha, se precipitó con isopropanol. El sedimento se lavó con etanol al 70% antes de resuspender en tampón de inyección. Antes de la inyección, el ADN limpia utilizando Millex-GV columna.

Buffer Izotonic:

1,68 M NaCl - 88,3 ml 1,68 M NaCl - 2,9 m 1 M Hepes -10,7 ml 1,12 M CaCl 2 a 2,2 ml dH 2 O - 896 ml

O

5 M NaCl - 29,67 ml KCl 1 M - 4,87 ml Hepes 1 M - 10,7 ml 1,12 M CaCl 2 a 2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml

Ajustar el pH a 7.2

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Injection Quartz needles		Sutter Instrument Co.		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Qiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification