の注入。ハマダラカの胚は、マラリア耐性の蚊を生成する

Summary

ハマダラカ蚊は、インドやアジア各地に生息するマラリアのためのベクトルです。このビデオでは、蚊にマラリアに抵抗性を付与される導入遺伝子でこの種のmicroinjectionsを実行するためのテクニックを示しています。このビデオで示されて方法論の多くは、他の蚊の種のマイクロインジェクション技術に適用可能である。

Abstract

蚊のゲノムへの外来遺伝子の導入は、関心のある特定の種に合わせたマイクロインジェクションの技術が必要です。このビデオプロトコルが変換された蚊の世代のためのハマダラカの胚にDNA構築物を顕微注入するためにジェームズ実験室で使用されるメソッドを示しています。 、マイクロインジェクションの針を準備する胚を収集し、準備やマイクロインジェクションを行うためのテクニックが示されている。

Protocol

マイクロインジェクションの事前準備：

1. 血液の供給蚊：月曜日から前の金曜日の水曜日のフィード女性の注射用。木曜日と金曜日を注入するために、同じ週の月曜日にフィード女性。
   
   
2. プログラム2と等張緩衝液を用いて石英の針を準備する（資料を参照）。
   
   
3. 胚は、"管を敷設する"定期的なショウジョウバエ培養バイアルです。それを覆うフィルター紙のウェットディスクと底に湿った脱脂綿、。
   
   
4. 一方の端に両面テープを貼り付けることによってプラスチックのカバースリップを準備します。それはカバースリップの端で終わるようにスリップをカバーするためにテープをトリミング。
   
   
5. 乾燥用のオイルを準備します。
   
   
6. 孵化のために胚を転送するために等張緩衝液でペトリ皿を準備します。

強制産卵のセットアップ：

1. アスピレーターの使用で60から10の血液供給の女性を収集し、綿と等張緩衝液で湿った濾紙を持つショウジョウバエ培養バイアルに移す。
   
   
2. 蚊は、暗所でinsectery条件に戻し入れ、1時間と15分間産卵のために許可されています。
   
   
3. 大人はケージに飛ぶと胚とろ紙ディスクを削除できます。
   
   
4. 卵を整列するために、解剖範囲でそれを行う。細かいペイントブラシ（セーブル、なし0000）と卵の房を収集し、等張緩衝液に浸した3MMワットマン濾紙の準備正方形に転送する。すべての時間は、湿紙を保管してください。卵は乾燥させないでください。ブラシでexochorionを削除、それは良いテープに卵を固執するのに役立ちます。
   
   
5. 細かいforcep第5または罰金絵筆を使用して、暗い灰色の胚をピックアップし、等張緩衝液で濡れた3MMワットマンの正方形の上の行に配置します。 20から30胚からの位置を合わせます。注射は、後極にあるとする必要があるため、すべての胚は、同じ向きになっている必要があります。胚の前端は、後部より少し幅が広いです。その後、3MMワットマン濾紙のストライプを使用して、卵が卵に触れていない、卵の線の両側にハードを押して、並んでいるフィルターを乾燥させる。
   
   
6. 卵を転送するには、両面テープ（医学）を含むスライドを反転し、静かに卵に対して押してください。卵の後端は、両面テープの端に非常に近いことがあります。それは彼らが固執しませんあまりにもウェットの場合、紙の湿潤は、このために不可欠です。私は5-10秒から胚の乾燥を行うが、乾燥時間は、マイクロインジェクション室の湿気と温度から依存する。
   
   
7. 乾燥は、卵のための非常に重要です：少し多すぎるビットと胚は孵化しません。乾燥のDNAなしで胚に行っていない。
   
   
8. さらに乾燥を防ぐために、ハロカーボンのオイルで乾燥胚をカバーしています。

胚のマイクロインジェクション：

良い注射の最も重要な側面は、針の品質です（注を参照）。

1. microloader（エッペンドルフ＃5242 956.003）を使用して注入されるようにDNA溶液を使用してニードルを埋めます。非常に少ない注射soliutionは、1〜2 mlを必要とされる。
   
   
2. 射出時間と圧力を制御するエッペンドルフTransjector、、だけでなく、背に針を接続してください。マイクロインジェクションは、× 10の倍率とマイクロマニピュレータ（ライカ）で移動ステージ（ライカ）と顕微鏡を使用して実行されます。必要に応じて、発生顕微鏡のステージ4〜5顕微鏡スライドを積層することにより調製することができる。発生段階に胚を運ぶカバースリップを置きます。胚は150 °の角度で注入され、普及率は、後極になっているはず。注射のために、私は針が静止して保持し、顕微鏡のステージに移動。針が新しいとき、先端を密封し、通常、最初の注射で分解されています。私はいつもそれぞれの注入の間に石油へのDNAの小さな液滴を追放するために必要な圧力をひねり出す。
   
   
3. 私は0.2に注入時間を設定する - 0.9秒と1000hPaのを針が新しいとき。小さな液滴が油に針から出てくる見られるまで私は、圧力と時間を変化させる。背圧は約100に設定する必要があります。針の先端が摩耗されるように、射出圧力は、注入量の低い（約300ヘクトパスカル）を保つために縮小する必要があります。この後は、針の先端が大きすぎると胚のほとんどを殺している。
   
   
4. 注入後は、ティッシュペーパーで油を除去し、胚および等張緩衝液でペトリ皿の場所でスライドをカバー。 insectoryに皿を置き、胚が孵化するまでそこにそれらを残す。彼らは2-6日後に孵化し始める。地上の魚の餌のピンチを蒸留水に幼虫を移す。

ノート

注入用DNA：プラスミドDNA溶液注入用はEndoFreeプラスミドキットを用いて単離した。右側の濃度で一緒にプラスミドとヘルパープラスミドミックスを構築、イソプロパノールで沈殿。ペレットは射出バッファーで再懸濁する前に70％エタノールで洗浄した。マイレクス- GVのカラムを使用して注入する前に、きれいなDNA。

Izotonicバッファ：

1.68 M NaClを - 88.3ミリリットル 1.68 MのNaCl - 2.9メートル 1 Mは-10.7 mlのHEPES 1.12 M塩化カルシウム2〜2.2ミリリットル のdH 2 O - 896ミリリットル

OR

5 M NaClを - 29.67ミリリットル 1 M塩化カリウム - 4.87ミリリットル 1 MのHepes - 10.7ミリリットル 1.12 M塩化カルシウム2〜2.2ミリリットル のdH 2 O - 952.56ミリリットル

pH7.2に調整する

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Injection Quartz needles		Sutter Instrument Co.		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Qiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification