Summary
아노 펠 레스 stephensi 모기가 말라리아 거주 인도 및 아시아 벡터입니다. 이 동영상은 모기에 말라리아에 대한 저항력을 부여합니다 transgenes이 종 microinjections을 수행하는 기법을 보여줍니다. 대부분이 동영상에서 보여주는 방법의 다른 모기 종의 microinjection 기술에 적용됩니다.
Abstract
모기의 genomes에 외인성 유전자의 도입은 관심의 특정 수종에 맞는 microinjection 기술을 필요로합니다. 이 비디오 프로토콜 변형 모기의 생성을위한 아노 펠 레스 stephensi의 배아에 DNA 구조를 microinject하는 제임스 실험실에서 사용하는 방법을 보여줍니다. , microinjection의 바늘을 준비하는 배아를 수집하고 준비하고 microinjection을 수행하기위한 기술은 그림입니다.
Protocol
microinjection 사전에 준비 :
- 혈액 공급 모기 : 월요일에서 이전 금요일에 수요일 피드 여자에 분사하십시오. 같은 주 월요일에 목요일과 금요일, 피드 여자를 삽입합니다.
- 프로그램 2 isotonic 버퍼 (자료 참조)를 사용하여 석영 바늘을 준비합니다.
- 배아에 대해 "튜브를 만들고 것은"일반 Drosophila 문화 약병입니다. 그것을 다루는 필터 종이 젖은 디스크와 함께 바닥에 젖은 탈지면.
- 권력을 더블 사이드 테이프를 대고 비닐 커버 신청서를 준비합니다. 그것이 커버 슬립의 가장자리에 끝이 너무 커버하는 트림 테이프 이구요.
- 탈수에 대한 오일을 준비합니다.
- 부화를위한 배아를 전송하는 isotonic 버퍼와 페트리 접시를 준비합니다.
강제 부설의 설정 :
- 흡인기를 이용하여 6-10 혈액 공급의 여자를 수집하고 면화와 isotonic 버퍼와 젖은 여과지로 Drosophila 문화 병을에게 전송할 수 있습니다.
- 모기는 다음 어둠 속에서 insectery 조건에 다시 넣고 1 H 15 분 알을 낳기 위해 사용할 수 있습니다.
- 성인 케이지로 비행하고 태아와 여과지 디스크를 제거하자.
- 계란 라인, 해부 현미경으로 그것을. 훌륭한 페인트 (사블, 아니 0000)로 달걀 한 움큼를 수집하고 isotonic 버퍼로 적셔 3MM 왓먼 용지 준비 광장에 전송할 수 있습니다. 모든 시간은 서부 유럽 표준시 종이 보관하십시오. 계란이 desiccated 내버려하지 마십시오. 브러시로 exochorion 제거 그것은 더 나은 테이프에 달걀을 붙어줍니다.
- 좋은 forcep 번호 5 벌금 페인트를 사용하여 어두운 회색 배아를 선택하고 isotonic 버퍼와 젖은 3MM 왓먼의 광장에 일렬로 배열. 20-30 배아에서 줄을. 주사는 후부 기둥에 갈 수있는 것처럼 모든 배아는 동일한 방향에 있어야합니다. 배아의 앞쪽에 끝이 뒷부분보다 약간 넓은 있습니다. 그런 다음, 3MM 왓먼 종이의 줄무늬를 사용하면, 계란은, 계란 라인의 양쪽에 하드 눌러 계란을 만질 의해 줄지어있는 필터를 건조.
- 계란을 전송, 이중 양면 테이프 (의학)이있는 슬라이드를 반전하고, 부드럽게 달걀에 대한 누르십시오. 계란의 뒷부분 끝 이중 양면 테이프의 가장자리에 아주 가까이해야합니다. 그것이 그들이 스틱되지 않습니다 너무 젖어있는 경우 용지의 촉촉한이 중요합니다. 나는 5-10초에서 태아의 탈수를하지만, 탈수 시간은 microinjection 방에 습기와 온도의 따라 달라집니다.
- 너무 조금 및 배아는 부화하지 않습니다 건조 계란은 중요합니다. 탈수의 DNA없이 배아로하지 않을 것입니다.
- 더 탈수를 방지하기 위해 할로 카본 오일 desiccated 배아를 커버.
배아의 Microinjection :
좋은 주입의 가장 중요한 부분은 (주 참조) 바늘의 품질입니다.
- microloader을 (Eppendorf # 5242 956.003)를 사용하여 주입하는 DNA 솔루션 바늘을 입력합니다. 아주 작은 주사 soliution은 1-2 ML이 필요합니다.
- 사출 시간과 압력을 제어하는 Eppendorf Transjector,뿐만 아니라 backpressure에 바늘을 연결합니다. Microinjection은 X 10 배율과 micromanipulator (Leica)에 이동 무대 (Leica)와 현미경을 사용하여 수행됩니다. 필요한 경우, 제기 현미경 스테이지는 4-5 현미경 슬라이드를 스태킹하여 준비 수 있습니다. 제기 무대에 배아를 가지고 커버 전표를 놓습니다. 배아는 150 °의 각도로 주입되며 보급률은 사후 극에서해야합니다. 주사, 그 바늘이 고정 유지하고 현미경의 단계로 이동합니다. 바늘이 새로운하면 끝은 봉인과 일반적으로 첫 번째 주입에서 봐야합니다. 나는 항상 각 분사 사이에 오일로 DNA의 작은 비말을 추방하는 데 필요한 압력을 작동합니다.
- 나는 0.2 분사 시간을 설정 - 0.9 초 1000 고전력 증폭기를 바늘이 새로운 경우에. 작은 비말이 오일로 바늘에서 나오는 볼 때까지 나는 압력 및 시간을 달라집니다. backpressure 100 주위를 설정해야합니다. 바늘 끝이 착용지면서, 사출 압력은 사출 볼륨을 낮은 (고전력 증폭기 약 300) 유지 줄일 수있다. 이 후, 바늘 끝이 너무 큽니다 및 배아의 대부분을 죽이고있다.
- 주입 후, 티슈로 기름을 제거하고 배아와 isotonic 버퍼와 배양 접시에있는 장소로 슬라이드를 커버. insectory에서 요리를 삽입하여 배아는 부화가있을 때까지 그들을 두십시오. 그들은 2~6일 후에 부화하기 시작합니다. 지상 물고기 음식 핀치와 증류수에 애벌레를 전송합니다.
노트
주사에 대한 DNA : 주사에 대한 플라스미드 DNA 솔루션은 EndoFree 플라스미드 키트를 사용하여 격리되었다.플라스미드 구축 및 오른쪽 농도 함께 도우미 플라스미드 믹스, 이소프로판올 함께 시켰던. 펠렛은 사출 버퍼 resuspending하기 전에 70 % 에탄올로 씻은했다. 전에 주입, Millex - GV 칼럼을 사용하여 청소 DNA.
Izotonic 버퍼 :
| 1.68 M NaCl - 88.3 ML 1.68 M NaCl - 2.9 m 1 M은 -10.7 ML을 Hepes 1.12 M CaCl 2-2.2 ML DH 2 O - 896 ML | 또는 | 5 M NaCl - 29.67 ML 1 M KCl - 4.87 ML 1 M의 Hepes - 10.7 ML 1.12 M CaCl 2-2.2 ML DH 2 O - 952.56 ML |
산도 7.2 조정
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection Quartz needles | Sutter Instrument Co. | O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller. | ||
| Quartz puller | Tool | Sutter Instrument Co. | P-2000 | Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| EndoFree plasmid kit | Qiagen | |||
| Isopropanol | ||||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | for DNA cleaning | ||
| Construct DNA | 0.5 mg/ml | |||
| Helper plasmid | 0.3 mg/ml | |||
| Injection solution | Buffer | 1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Isotonic buffer | see recipe in the protocol section | |||
| Dessication oil | Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection. | |||
| Blood | to feed mosquitos | |||
| Anopheles stephensi | Animal | Mosquitos, male and female. | ||
| Drosophila culture vial | for egg laying | |||
| Petri dishes | with isotonic buffer, for embryo hatching | |||
| Fine paintbrush | Sable # 0000 | |||
| 3MM Whatman paper | ||||
| Forceps #5 | ||||
| double sided tape | ||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Transjector | Eppendorf | |||
| Microscope | Leica Microsystems | with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification |
