Biology

एक के इंजेक्शन. stephensi भ्रूण मलेरिया - प्रतिरोधी मच्छरों को उत्पन्न करने के लिए

Published: July 4, 2007 doi: 10.3791/216

Olle Terenius¹, Jennifer Juhn¹, Anthony A. James²

¹Department of Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine (UCI), ²Department of Molecular Biology and Biochemistry, Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Irvine (UCI)

Summary

एनोफ़ेलीज़ stephensi मच्छरों मलेरिया inhabiting भारत और एशिया भर के लिए वैक्टर हैं. यह वीडियो transgenes कि मच्छर को मलेरिया के लिए प्रतिरोध प्रदान करेंगे के साथ इस प्रजाति की microinjections प्रदर्शन के लिए तकनीक को दर्शाता है. इस वीडियो में प्रदर्शन कार्यप्रणाली के ज्यादातर अन्य मच्छर प्रजातियों के microinjection तकनीकों को लागू है.

Abstract

मच्छरों के जीनोम में exogenous जीन की शुरूआत microinjection विशिष्ट प्रजातियों के लिए ब्याज की अनुरूप तकनीक की आवश्यकता है. यह वीडियो एक जेम्स प्रयोगशाला द्वारा प्रयोग किया जाता विधि एनोफ़ेलीज़ stephensi भ्रूण में तब्दील मच्छरों की पीढ़ी के लिए डीएनए constructs microinject प्रोटोकॉल को दर्शाता है. Microinjection सुइयों की तैयारी, इकट्ठा करने और भ्रूण की तैयारी और microinjection प्रदर्शन के लिए तकनीक सचित्र हैं.

Protocol

Microinjection के अग्रिम में तैयार:

रक्त फ़ीड मच्छरों: सोमवार से बुधवार को पिछले शुक्रवार को फ़ीड महिलाओं को इंजेक्शन के लिए. सोमवार को एक ही सप्ताह के गुरुवार और शुक्रवार, फ़ीड महिलाओं इंजेक्षन.
क्वार्ट्ज सुइयों 2 कार्यक्रम और isotonic बफर (सामग्री देखें) का उपयोग कर तैयार है.
भ्रूण के लिए "ट्यूब लेटो" नियमित ड्रोसोफिला संस्कृति शीशी है. नीचे में गीले कपास इसे कवर फिल्टर कागज के एक गीला डिस्क के साथ, ऊन.
एक छोर पर डबल साइड टेप चिपका द्वारा प्लास्टिक कवर पर्ची तैयार करें. पर्ची छाँटो टेप करने के लिए कवर इतना है कि यह कवर पर्ची के किनारे पर समाप्त होता है.
Desiccation के लिए तेल तैयार.
Isotonic बफर के साथ एक पेट्री डिश तैयार अंडे सेने के लिए भ्रूण स्थानांतरण.

मजबूर बिछाने से सेट अप:

एक Aspirator के उपयोग के साथ 6-10 रक्त खिलाया महिलाओं लीजिए और उन्हें कपास और फिल्टर isotonic बफर के साथ गीला कागज के साथ ड्रोसोफिला संस्कृति शीशी को हस्तांतरण.
मच्छरों रहे हैं तो अंधेरे में insectery स्थितियों में वापस डाल दिया है और 1 घंटे और 15 मिनट के लिए अंडे देना की अनुमति.
वयस्कों के पिंजरे में उड़ान भरने के लिए और भ्रूण के साथ फिल्टर पेपर डिस्क को हटाने.
अंडे लाइन के लिए, यह विदारक गुंजाइश के तहत करते हैं. एक ठीक तूलिका (सेबल नहीं, 0000) के साथ अंडे के bunches ले लीजिए और 3mm वाटमान isotonic बफर के साथ लथपथ कागज के एक तैयार वर्ग को हस्तांतरण. कागज रखें सभी समय गीला. अंडे desiccated मिल मत करो. ब्रश के साथ exochorion निकालें, यह टेप करने के लिए बेहतर अंडे छड़ी में मदद करता है.
ठीक forcep 5 सं या एक ठीक तूलिका का प्रयोग, गहरे भूरे भ्रूण लेने और 3mm isotonic बफर के साथ गीला वाटमान के चौराहे पर लाइन में व्यवस्था. 20-30 भ्रूण से रेखा. सभी भ्रूण के रूप में इंजेक्शन के पीछे ध्रुव पर हो गया है एक ही ओरिएंटेशन में होना चाहिए. भ्रूण के पूर्वकाल अंत थोड़ा पीछे की तुलना में व्यापक है. फिर, 3mm वाटमान कागज की पट्टियों का उपयोग, फिल्टर जहां अंडे अंडे लाइन के दोनों पक्षों पर कड़ी दबाने छू अंडे नहीं लाइन में खड़ा कर रहे हैं सूखी.
अंडे हस्तांतरण करने के लिए, डबल पक्षीय टेप (चिकित्सा) युक्त स्लाइड पलटना, और धीरे अंडे के खिलाफ दबाएँ. अंडे के पीछे के अंत करने के लिए डबल पक्षीय टेप के किनारे करने के लिए बहुत करीब है. कागज की नमी के लिए महत्वपूर्ण है, अगर वे छड़ी नहीं होगा यह भी गीला है. मैं 5-10 दूसरे से भ्रूण के desiccation करते हैं, लेकिन desiccation समय नम और microinjection कमरे में तापमान से निर्भर करता है.
Desiccation अंडे के लिए महत्वपूर्ण है: थोड़ा बहुत ज्यादा है और भ्रूण नहीं हैच जाएगा. Desiccation डीएनए के बिना भ्रूण में नहीं जा रहा है.
हेलोकार्बन तेल के साथ desiccated भ्रूण आगे desiccation को रोकने के कवर.

भ्रूण के Microinjection:

अच्छा इंजेक्शन का सबसे महत्वपूर्ण पहलू सुई की गुणवत्ता है (नोट देखें).

डीएनए microloader (Eppendorf 956.003 5242 #) का उपयोग करके इंजेक्शन जा समाधान के साथ एक सुई भरें. बहुत थोड़ा इंजेक्शन soliution की जरूरत है, 1 से 2 मिलीलीटर.
Eppendorf Transjector, जो इंजेक्शन समय और दबाव नियंत्रण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से backpressure सुई कनेक्ट. Microinjection x 10 बढ़ाई और micromanipulator (Leica) पर एक से बढ़ चरण (Leica) के साथ एक खुर्दबीन का उपयोग किया जाता है. यदि आवश्यक हो, एक उठाया खुर्दबीन मंच 4-5 खुर्दबीन स्लाइड stacking द्वारा तैयार किया जा सकता है. कवर उठाया मंच पर पर्ची ले जाने भ्रूण रखें. भ्रूण एक 150 ° के कोण पर इंजेक्शन हैं; पीछे पोल में प्रवेश किया जाना चाहिए. इंजेक्शन के लिए, मैं सुई स्थिर रखने के लिए और माइक्रोस्कोप के चरण ले जाने के. जब सुई नया है, टिप सील है और आम तौर पर पहले इंजेक्शन में टूट जाता है. मैं हमेशा से बाहर तेल में प्रत्येक इंजेक्शन के बीच में डीएनए का एक छोटा सा छोटी बूंद को निष्कासित करने की जरूरत दबाव काम करते हैं.
मैं 0.2 करने के लिए इंजेक्शन समय सेट - 0.9 सेकंड और 1000 एचपीए जब सुई नया है. मैं दबाव और समय भिन्न है जब तक एक छोटी सी छोटी बूंद सुई से तेल में बाहर आ देखा है. backpressure करीब 100 सेट की जरूरत है. सुई टिप के रूप में पहना जाता है, इंजेक्शन दबाव करने के लिए इंजेक्शन की मात्रा कम (के बारे में 300 एचपीए) रखने के लिए कम हो गया है. इस के बाद, सुई टिप बहुत बड़ी है और भ्रूण के सबसे हत्या.
इंजेक्शन के बाद, टिशू पेपर के साथ तेल निकालने और भ्रूण और isotonic बफर के साथ पेट्री डिश में जगह के साथ स्लाइड को कवर. Insectory में बर्तन प्लेस और उन्हें वहाँ छोड़ जब तक भ्रूण हैच. वे 2-6 दिनों के बाद हैच शुरू करते हैं. आसुत जल जमीन मछली भोजन की चुटकी के साथ लार्वा स्थानांतरण.

नोट्स

इंजेक्शन के लिए डीएनए: इंजेक्शन के लिए डीएनए प्लाज्मिड समाधान EndoFree प्लाज्मिड किट का उपयोग कर पृथक किया गया.प्लाज्मिड निर्माण और हेल्पर सही एकाग्रता में प्लाज्मिड मिश्रण एक साथ, isopropanol साथ उपजी. गोली 70% इथेनॉल के साथ इंजेक्शन बफर में resuspending से पहले धोया था. इससे पहले इंजेक्शन, स्वच्छ Millex - जीवी स्तंभ का उपयोग डीएनए.

Izotonic बफर:

1.68 एम NaCl 88.3 मिलीलीटर -

1.68 एम NaCl - 2.9 मीटर

एम 1 -10.7 मिलीलीटर Hepes

1.12 एम ₂ CaCl - 2.2 मिलीलीटर

DH ₂ हे 896 मिलीलीटर -

या

एम NaCl 29.67 मिलीलीटर - 5

एम KCl 4.87 मिलीलीटर - 1

10.7 मिलीलीटर - एम 1 Hepes

1.12 एम ₂ CaCl - 2.2 मिलीलीटर

DH ₂ हे 952.56 मिलीलीटर -

7.2 पीएच को समायोजित करें

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Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Injection Quartz needles		Sutter Instrument Co.		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Qiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification