Summary
Anopheles stephensi комары являются переносчиками малярии населяющие Индию и по всей Азии. Это видео демонстрирует технику для выполнения микроинъекций этого вида с трансгенов которые придают устойчивость к малярии комаров. Большая часть методологии продемонстрировали в этом видео применима к микроинъекции методов других видов комаров.
Abstract
Введение экзогенных генов в геноме комаров требует микроинъекции методов с учетом конкретных видов, представляющих интерес. Это видео демонстрирует протокол метод, используемый Джеймсом лаборатории microinject конструкций ДНК в эмбрионы Anopheles stephensi для генерации трансформированных комаров. Методы подготовки микроинъекции иглы, сбора и подготовки эмбрионов и выполнения микроинъекции проиллюстрированы.
Protocol
Подготовка заранее микроинъекции:
- Кровь комаров кормить: для инъекций с понедельника по среду кормить самок на предыдущую пятницу. Чтобы придать четверг и пятницу, кормить самок на понедельник на той же неделе.
- Подготовка Кварцевые иглы с помощью программы 2 и изотонического раствора (см. материалы).
- "Укладка трубы" для эмбрионов регулярные культуры дрозофилы флаконе. Влажная вата в низу, с мокрыми диск фильтровальной бумаги ее освещении.
- Подготовка пластического скольжения покрытие, придерживаясь двухсторонней ленты в один конец. Обрежьте ленту покровным стеклом так, что оно заканчивается на краю крышки скольжения.
- Подготовка масло для высыхания.
- Подготовка чашки Петри с изотоническим буфером для передачи эмбрионов для штриховки.
Настройка принудительного укладки:
- Сбор крови 6-10 кормили самок с использованием аспиратора и передавать их на флаконе дрозофилы культуры с хлопком и фильтровальная бумага мокрая от изотонического буфера.
- Комары затем поместить обратно в insectery условиях в темноте и позволили, чтобы отложить яйца в течение 1 ч и 15 мин.
- Давайте взрослых летят в клетку и удалить фильтр диск бумаги с эмбрионами.
- Для выстраиваются яйца, делать это под рассекает области. Сбор пучки яйца с тонкой кистью (Соболь, № 0000) и передача подготовленной квадрат 3MM ватмане пропитанный изотоническом буфере. Держите бумагу все время влажным. Не позволяйте яйца получить сухие. Удалить exochorion с кистью, это помогает лучше придерживаться яйца на ленту.
- Использование тонких forcep № 5 или штраф кисть, подобрать темный серый эмбрионов и организовать в соответствии с квадратом 3 мм Whatman мокрым изотоническом буфере. Линия по сравнению с 20-30 эмбрионов. Все эмбрионы должны быть в той же ориентации, инъекция должна быть на заднем полюсе. Передний конец эмбрионов немного шире, чем задняя. Затем, используя полосы 3MM ватмане, сухой фильтр, где яйца выстроились нажав жесткий по обе стороны линии яйцо, не задевая яйца.
- Для передачи яйца, инвертировать слайд, содержащий двусторонний скотч (медицина), и мягко давить яйца. Заднем конце яйца должны быть очень близко к краю двусторонний скотч. Влажность бумаги имеет решающее значение для этого, если он слишком влажный они не будут палки. Я высыхания эмбрионов от 5-10 секунды, но высыхание время зависит от влажности и температуры в микроинъекции комнате.
- Сушка имеет решающее значение для яиц: немного слишком много, и эмбрионы не будут люк. Без высыхания ДНК не вдаваясь в зародыше.
- Обложка сухие эмбрионов с галоидоуглеводородов масла, чтобы предотвратить дальнейшее высыхание.
Микроинъекции эмбрионы:
Наиболее важным аспектом хорошей инъекции качество иглы (см. примечание).
- Заполните игла с ДНК раствор вводят с помощью microloader (Eppendorf 5242 # 956,003). Очень мало soliution инъекция необходима, от 1 до 2 мл.
- Подключите иглы Эппендорф Transjector, которая контролирует времени впрыска и давления, а также противодавления. Микроинъекция выполняется с помощью микроскопа с движущейся этапе (Leica) при увеличении х 10 и микроманипулятора (Leica). Если необходимо, поднял столик микроскопа могут быть получены путем укладки 4-5 слайды микроскопом. Место проведения покровным стеклом эмбрионов на приподнятой сцене. Эмбрионы вводятся на 150 градусов; проникновение должно быть у заднего полюса. Для инъекций, я держу иглу стационарных и перемещать столик микроскопа. Когда игла новый, запечатанный наконечник и, как правило перерывы в первой инъекции. Я всегда получается давление, необходимое для изгнать маленькая капелька ДНК в нефти между каждой инъекции.
- Я установил время впрыска до 0,2 - 0,9 сек и 1000 гПа, когда игла находится новое. Я меняться давление и время, пока маленькая капелька видна, выходящий из иглы в масле. Противодавление должно быть установлено около 100. Как иглы изнашивается, давление впрыска должна быть уменьшена держать низкие объемом впрыска (около 300 гПа). После этого кончик иглы слишком велик, и убивает большинство из эмбрионов.
- После инъекции, удалять масла салфеткой и покрывают слайд с эмбрионами и место в чашке Петри с изотоническом буфере. Место блюда в insectory и оставить их там, пока эмбрионов люк. Они начинают выводятся через 2-6 дней. Передача личинки к дистиллированной воды с щепоткой земли пищу рыбу.
Примечания
ДНК для инъекций: плазмиды ДНК решение для инъекций выделяли с помощью плазмиды EndoFree комплект.Построить плазмиды и помощник плазмиды смешать в правильной концентрации, осаждали изопропанола. Осадок промывают 70% этанолом до ресуспендирования в инъекции буфера. Перед инъекцией, чистой ДНК с использованием Millex-GV колонке.
Izotonic буфера:
| 1,68 М NaCl - 88,3 мл 1,68 М NaCl - 2,9 м 1 М Hepes -10,7 мл 1,12 М CaCl 2 - 2,2 мл дН 2 O - 896 мл | ИЛИ | 5 М NaCl - 29,67 мл 1 М KCl - 4,87 мл 1 М Hepes - 10,7 мл 1,12 М CaCl 2 - 2,2 мл дН 2 O - 952,56 мл |
Отрегулируйте до рН 7,2
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection Quartz needles | Sutter Instrument Co. | O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller. | ||
| Quartz puller | Tool | Sutter Instrument Co. | P-2000 | Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141 |
| EndoFree plasmid kit | Qiagen | |||
| Isopropanol | ||||
| Millex-GV column | SLGV RO4 NL | for DNA cleaning | ||
| Construct DNA | 0.5 mg/ml | |||
| Helper plasmid | 0.3 mg/ml | |||
| Injection solution | Buffer | 1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8 | ||
| Isotonic buffer | see recipe in the protocol section | |||
| Dessication oil | Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection. | |||
| Blood | to feed mosquitos | |||
| Anopheles stephensi | Animal | Mosquitos, male and female. | ||
| Drosophila culture vial | for egg laying | |||
| Petri dishes | with isotonic buffer, for embryo hatching | |||
| Fine paintbrush | Sable # 0000 | |||
| 3MM Whatman paper | ||||
| Forceps #5 | ||||
| double sided tape | ||||
| Microloader | Eppendorf | 5242 956.003 | ||
| Transjector | Eppendorf | |||
| Microscope | Leica Microsystems | with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification |
