Injection d'un. Embryons stephensi pour générer le paludisme résistant à moustiques

Summary

Moustiques Anopheles stephensi sont des vecteurs de la malaria qui habitent en Inde et en Asie. Cette vidéo montre la technique pour effectuer des micro-injections de cette espèce avec des transgènes qui confèrent une résistance à la malaria au moustique. Une grande partie de la méthodologie démontrée dans cette vidéo est applicable à des techniques de micro-injection d'autres espèces de moustiques.

Abstract

L'introduction de gènes exogènes dans les génomes des moustiques nécessite des techniques de micro-injection adaptés aux espèces d'intérêt particulier. Ce protocole vidéo montre une méthode utilisée par le laboratoire de James microinject constructions d'ADN dans des embryons stephensi Anopheles pour la génération de moustiques transformé. Les techniques de préparation des aiguilles de microinjection, la collecte et la préparation des embryons et l'exécution des micro-injection sont illustrés.

Protocol

Préparation à l'avance de la micro-injection:

1. Moustiques nourrissent de sang: pour l'injection du lundi au mercredi femelles se nourrissent le vendredi précédent. Pour injecter jeudi et vendredi, les femelles se nourrissent le lundi de la même semaine.
   
   
2. Préparer les aiguilles à quartz utilisant le programme 2 et tampon isotonique (voir matériaux).
   
   
3. "Pose du tube" pour les embryons est le flacon de culture régulière drosophile. Coton humide dans le fond, avec un disque de papier filtre humide qui la recouvre.
   
   
4. Préparer lamelle en plastique en collant double-face de la cassette à une extrémité. Bande de garniture à lamelle afin qu'elle se termine au bord de lamelle.
   
   
5. Préparer l'huile pour la dessiccation.
   
   
6. Préparez une boîte de Pétri avec tampon isotonique de transférer les embryons à couver.

Mise en place de la pose forcée:

1. Recueillir le sang de 60 à 10 femelles nourries avec l'utilisation d'un aspirateur et de les transférer dans le flacon de culture de drosophiles avec du coton et du papier filtre humide avec tampon isotonique.
   
   
2. Les moustiques sont ensuite remis en conditions insectery dans l'obscurité et autorisés à pondre des oeufs pendant 1 h et 15 min.
   
   
3. Laissez adultes volent dans la cage et retirez le disque de papier filtre avec des embryons.
   
   
4. Pour aligner les œufs, le faire sous la portée de dissection. Recueillir des grappes d'oeufs avec un pinceau fin (Sable, No 0000) et le transfert à un carré préparés de papier Whatman 3MM imbibé de tampon isotonique. Conservez le papier tous les temps humides. Ne laissez pas les œufs se dessèchent. Retirez le exochorion avec le pinceau, il aide à mieux coller les oeufs sur la bande.
   
   
5. Utiliser fines pince n ° 5 ou un pinceau fin, ramasser embryons gris foncé et d'organiser en ligne sur le carré du papier Whatman 3MM humide avec un tampon isotonique. Line up de 20 à 30 embryons. Tous les embryons doivent être dans la même orientation que l'injection doit être au pôle postérieur. L'extrémité antérieure de l'embryon est légèrement plus large que le postérieur. Puis, en utilisant des bandes de papier Whatman 3MM, sécher le filtre où les œufs sont alignés en appuyant fort sur les deux côtés de la ligne d'oeuf, ne pas toucher les oeufs.
   
   
6. Pour transférer les œufs, inverser la diapositive contenant le ruban adhésif double face (Médecine), et appuyez doucement contre les oeufs. L'extrémité postérieure des œufs doivent être très proches du bord de l'adhésif double face. L'humidité du papier est essentiel pour cela, si elle est trop humide, ils ne collent pas. Je ne la dessiccation des embryons de la deuxième 5-10, mais le temps de dessiccation dépend de l'humide et la température dans la chambre de la micro-injection.
   
   
7. La dessiccation est cruciale pour les oeufs: peu trop et les embryons ne seront pas éclore. Sans l'ADN de dessiccation n'est pas d'entrer dans l'embryon.
   
   
8. Couverture embryons desséchés avec de l'huile d'halocarbures pour éviter la dessiccation plus loin.

Microinjection des embryons:

L'aspect le plus important de l'injection est la qualité de l'aiguille (voir note).

1. Remplir une seringue avec la solution d'ADN à injecter en utilisant un microloader (Eppendorf # 5242 956,003). Très peu d'injection soliution est nécessaire, 1 à 2 ml.
   
   
2. Connectez l'aiguille à la Transjector Eppendorf, qui contrôle le temps d'injection et de pression, ainsi que la contre-pression. La microinjection est réalisée à l'aide d'un microscope avec une scène en mouvement (Leica) à un grossissement x 10 et micromanipulateur (Leica). Si nécessaire, une platine de microscope soulevées peuvent être préparés par l'empilement de lames de microscope 4-5. Placer la lamelle transportant des embryons sur scène surélevée. Les embryons sont injectés à un angle de 150 °; pénétration doit être au pôle postérieur. Pour l'injection, je garde l'aiguille immobile et déplacer le platine du microscope. Lorsque l'aiguille est nouveau, la pointe est scellée et les pauses habituellement dans la première injection. Je travaille toujours sur la pression nécessaire pour expulser une petite goutte d'ADN dans l'huile entre chaque injection.
   
   
3. J'ai mis du temps d'injection de 0,2 à 0,9 sec et 1000 hPa lorsque l'aiguille est nouveau. Je varie la pression et le temps jusqu'à ce qu'une gouttelette est petite vu sortir de l'aiguille dans l'huile. La contre-pression doit être réglée à environ 100. Comme l'aiguille s'use, la pression d'injection doit être réduite pour garder le faible volume d'injection (environ 300 hPa). Après cela, la pointe de l'aiguille est trop grande et tue la plupart des embryons de l'.
   
   
4. Après l'injection, enlever l'huile avec du papier absorbant et recouvrir la lame avec les embryons et les placer dans la boîte de Pétri avec le tampon isotonique. Placez les plats dans le insectory et les y laisser jusqu'à ce que les embryons éclosent. Ils commencent à éclore après 2-6 jours. Transfert aux larves de l'eau distillée avec la pincée de nourriture pour poissons sol.

Remarques

L'ADN pour l'injection: la solution pour injection d'ADN plasmidique a été isolé en utilisant Endofree kit plasmide.Construire le plasmide et mélanger plasmide assistant ensemble dans la bonne concentration, précipité à l'isopropanol. Le culot a été lavé avec de l'éthanol 70% avant la remise en suspension dans le tampon d'injection. Avant l'injection, l'ADN propre à l'aide Millex-GV colonne.

Buffer Izotonic:

1,68 M de NaCl - 88,3 ml 1,68 M de NaCl - 2,9 m 1 M HEPES -10,7 ml 1,12 M CaCl 2 à 2,2 ml dH 2 O - 896 ml

OU

NaCl 5 M - 29,67 ml 1 M KCl - 4,87 ml 1 Hepes M - 10,7 ml 1,12 M CaCl 2 à 2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml

Ajuster à pH 7,2

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Injection Quartz needles		Sutter Instrument Co.		O.D.- 1.0 mm, I.D.-0.70, 10 cm length, are prepared by drawing capillary tubing into a fine 3-8 um with a shaft of approximately 100-300 mm micropipette puller.
Quartz puller	Tool	Sutter Instrument Co.	P-2000	Set-up: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141
EndoFree plasmid kit		Qiagen
Isopropanol
Millex-GV column			SLGV RO4 NL	for DNA cleaning
Construct DNA				0.5 mg/ml
Helper plasmid				0.3 mg/ml
Injection solution	Buffer			1x solution: 5mM KCl, 0.1mM sodium phosphate, ph 6. 8
Isotonic buffer				see recipe in the protocol section
Dessication oil				Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). Mix well. Prepare in advance of microinjection.
Blood				to feed mosquitos
Anopheles stephensi	Animal			Mosquitos, male and female.
Drosophila culture vial				for egg laying
Petri dishes				with isotonic buffer, for embryo hatching
Fine paintbrush				Sable # 0000
3MM Whatman paper
Forceps #5
double sided tape
Microloader		Eppendorf	5242 956.003
Transjector		Eppendorf
Microscope		Leica Microsystems		with moving stage and micromanipulator, set at 10x magnification