Summary
पूरे भ्रूण संस्कृति तकनीक हमें संस्कृति माउस और चूहा भ्रूण करने की अनुमति देता है
Abstract
पूरे भ्रूण संस्कृति तकनीक (WEC) नई और उनके सहयोगियों द्वारा 1950 में विकसित किया गया है, और विकास एक जीव विज्ञान के लिए लागू होता है. हालांकि और स्तनधारी भ्रूण के विकास गंभीर नाल के समारोह पर निर्भर हैं, WEC तकनीक संस्कृति माउस और चूहा भ्रूण पूर्व vivo हालत के लिए हमें भ्रूण दिन (ई) 6.5 E12.5 के दौरान सीमित midgestation चरणों इसी अवधि के दौरान अनुमति देता है माउस या E8.5 - E14.5 2 चूहे, 3, 4 में. WEC में, हम सीधे ठीक कांच capillaries का उपयोग भ्रूण के क्षेत्रों वांछित कर सकते हैं लक्ष्य है क्योंकि भ्रूण खुर्दबीन के नीचे चालाकी से किया जा सकता है. इसलिए, कृंतक WEC तकनीक बहुत उपयोगी है जब हम गतिशील postimplanted स्तनधारी भ्रूण के विकास की प्रक्रिया का अध्ययन करना चाहते हैं. तारीख तक, WEC प्रणालियों के कई प्रकार है 1 विकसित किया गया है . उन के अलावा, अंग को घुमानेवाली पेशी प्रकार बोतल संस्कृति प्रणाली E9.5 और E11.5 माउस और चूहे में क्रमशः एक के बाद सबसे लोकप्रिय और midgestation, अर्थात् में भ्रूण की लंबी अवधि संस्कृति के लिए उपयुक्त है. इस वीडियो प्रोटोकॉल में, हम E12.5 मूल अंग को घुमानेवाली पेशी प्रणाली, जो नई और 5 Cockroft, 6 द्वारा डिजाइन किया गया था एक परिष्कृत मॉडल का उपयोग कर के बाद चूहे WEC के हमारे मानक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन, और स्तनधारी विकास में WEC तकनीक के अध्ययन के लिए विभिन्न अनुप्रयोगों का परिचय जीव विज्ञान.
Protocol
1. WEC प्रणाली की स्थापना
- संयुक्त 0.22 सुक्ष्ममापी WEC प्रणाली के भीतर प्रवेश सिलिकॉन ट्यूब फिल्टर झिल्ली).
- 2 हे (95%) और सीओ 2 (5%) युक्त एक गैस सिलेंडर के वाल्व खोलें. बुदबुदाती autoclaved पानी युक्त बोतल के माध्यम से ड्रम में गैस मिश्रण फ्लो.
- 50 सीसी गैस मिश्रण के प्रवाह की मात्रा समायोजित करें.
- सम्मिलित बाहर एक पानी की बोतल में सिलिकॉन ट्यूब और गैस मिश्रण के प्रवाह की जाँच करें.
- 20 rpm / मिनट की गति पर ड्रम घुमाएँ.
2. संस्कृति के माध्यम तैयार
- पिघलना चूहा (आईसी) 37.0 पर तुरंत centrifuged सीरम ° C ख). जोड़ें एक autoclaved 100 मिलीलीटर बीकर में thawed सीरम में डी ग्लूकोज (2 मिलीग्राम / एमएल). संस्कृति मध्यम प्राथमिक संस्कृति स्तर (जैसे, एक डाकू का उपयोग) में तैयार किया जाना चाहिए.
- 400 कमजोर पड़ने: सीरम 1 के साथ (100X) एंटीबायोटिक antimycotic तरल जोड़ें.
- शेष isoflurane कमरे के तापमान (आरटी) ग) पर 20 मिनट के लिए सीरम से भाप बनकर (चूहों के संज्ञाहरण के कारण रक्त इकट्ठा के दौरान ).
- संस्कृति एक 0.45 सुक्ष्ममापी झिल्ली फिल्टर का उपयोग मध्यम जीवाणुरहित.
- प्रत्येक संस्कृति बोतल में मध्यम के 3.0 मिलीलीटर डालो और एक सिलिकॉन प्लग के साथ प्रत्येक बोतल, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर के ऊपर सील रेफरी देख (14.) घ) .
- तीन या चार निपटान पेट्री Tyrode खारा ई युक्त व्यंजन तैयार).
3. चूहे और गर्भाशय के अलगाव के संज्ञाहरण
- एक समय पर गर्भवती चूहा गहरा anesthetize inhalational या parenteral anesthetics के साथ.
- 70% इथेनॉल के साथ anesthetized गर्भवती चूहे के पेट क्षेत्र साफ़.
- संदंश के साथ त्वचा को उठाओ और बड़ी कैंची च के साथ त्वचा को काटने से पेट की दीवार अमल में लाना ).
- संदंश की एक जोड़ी के साथ पेट की दीवार उठाओ और U-आकार की बड़ी कैंची के साथ पेट की दीवार पर बड़े अनुदैर्ध्य चीरों बनाने के वक्ष स्तर छ ).
- संदंश की एक जोड़ी के साथ बाईं ओर दूर करने के लिए आंत और अंडाशय से जुड़े गर्भाशय के एक छोर बेनकाब रखिए.
- संदंश की एक जोड़ी के साथ गर्भाशय के अंत उठाओ और बड़ी कैंची से गर्भाशय और अंडाशय के बीच स्थिति में कटौती.
- गर्भवती चूहे से गर्भाशय गर्भाशय के दूसरे छोर तक गर्भाशय के आसपास वसा के काटने से बाहर ले लो.
- एक पेट्री Tyrode खारा युक्त पकवान गर्भाशय स्थानांतरण.
- Anesthetics के अत्यधिक प्रशासन या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से गर्भाशय को हटाने के बाद चूहे euthanize.
4. भ्रूण का गर्भाशय से हटाया
- संक्षेप में Tyrode खारा में गर्भाशय कुल्ला और यह ठीक संदंश घंटे की एक जोड़ी के साथ दूसरे पेट्री डिश को हस्तांतरण) .
- एक द्विनेत्री माइक्रोस्कोप के तहत, ठीक संदंश की एक जोड़ी के साथ गर्भाशय की दीवार को लेने और पक्ष विपरीत में नेत्र सीधे कैंची का उपयोग कर रक्त वाहिकाओं के साथ जोड़ने mesometrium के लिए गर्भाशय की दीवार में कटौती.
- गर्भाशय की दीवार और decidua के बीच अंतरिक्ष में नेत्र सीधे कैंची की नोक डालें. कट antimesometrial पक्ष के साथ longitudinally गर्भाशय की दीवार.
- पेड़ों का झुरमुट mesometrial पक्ष में decidua और गर्भाशय से अलग conceptuses ठीक मैं संदंश) के दो जोड़े का उपयोग .
- निष्फल ग्लास विंदुक के साथ एक उपयुक्त व्यास के साथ तीसरे पेट्री डिश conceptuses स्थानांतरण.
5. चूहा भ्रूण के विच्छेदन
- Decidua में microforceps के एक टिप सम्मिलित करें और संदंश के दो जोड़े के साथ conceptus आसपास decidua पर एक अनुप्रस्थ चीरा बनाने.
- Decidua में संदंश के सुझावों और placental पक्ष में सम्मिलित करें शीर्ष पर decidua पर दो अनुदैर्ध्य चीरों बना.
- Placental पक्ष में है कि संदंश के दो जोड़े के साथ बाहर तेजस्वी द्वारा decidua निकालें. संदंश के दो जोड़े के साथ शेष decidua निकालें.
- रीचर्ट झिल्ली उठाओ, उस पर एक क्षैतिज चीरा बनाने, और विरोधी अपरा पक्ष में conceptus से झिल्ली अलग.
- संदंश के दो जोड़े के साथ भ्रूण के सिर के पास जर्दी थैली पर एक छोटा सा छेद बनाओ, और नेत्र घुमावदार कैंची की एक जोड़ी के साथ की जर्दी थैली में कटौती. यह महत्वपूर्ण है प्रमुख रक्त वाहिकाओं को नुकसान नहीं है.
- भ्रूण के सिर के चारों ओर साइट पर ठीक संदंश के दो जोड़े के साथ amnion, उठाओ और धीरे से बाहर की जर्दी थैली से amnion घंटे फाड़ द्वारा भ्रूण) खींच . भ्रूण के शरीर की जर्दी थैली बाहर निकाला जाना चाहिए midgestation चरण में भ्रूण के लिए ऑक्सीजन की आपूर्ति में वृद्धि.
6. पूरे भ्रूण संस्कृति
- नाल, जर्दी थैली, और दिल की धड़कन और रक्त परिसंचरण की शर्त पर नुकसान की जाँच करें.
- गर्भनाल नहीं खींच के बारे में पता होने के नाते स्थानांतरण,एक निष्फल ग्लास विंदुक के साथ एक संस्कृति बोतल भ्रूण. Tyrode खारा की संस्कृति की बोतलों के लिए ले जाने के रूप में संभव के रूप में में छोटे होना चाहिए.
- एक गैर छेद अंग को घुमानेवाली पेशी ड्रम से सिलिकॉन प्लग निकालें. एक प्लग के साथ संस्कृति बोतल WEC प्रणाली के अंग को घुमानेवाली पेशी लंबरूप ड्रम के लिए एक छेद के साथ कनेक्ट. ड्रम पर बल अनुपयुक्त दिशाओं में नहीं है के बाद से अंग को घुमानेवाली पेशी ड्रम एक बहुत अच्छा उपकरण है डाल करने के लिए सावधान रहें. dissected भ्रूण युक्त बोतलें एक करके एक संस्कृति को स्थानांतरित कर रहे हैं, इनक्यूबेटर के सामने दरवाजे के खुलने जम्मू कमी आई है इनक्यूबेटर के तापमान से बचने के कम से कम होना चाहिए).
- संस्कृति के 10 घंटा बाद, गैस मिश्रण के प्रवाह की मात्रा को बढ़ाने के 24 घंटे के बाद 75 सीसी और 100 सीसी के लिए (तालिका 1).
- संस्कृति के माध्यम हौसले से तैयार मध्यम के साथ एक नई संस्कृति की बोतल में सुसंस्कृत भ्रूण स्थानांतरित द्वारा 24 घंटे के आसपास बदला जाना चाहिए. 125 सीसी तक 34 घंटा के बाद प्रवाह की मात्रा बढ़ाएँ 48 घंटा के बाद 150 सीसी (तालिका 1)
- कभी कभी दिल की धड़कन की दर (यानी, 120-150/min, इष्टतम है) की गणना के द्वारा और रक्त परिसंचरण को देख कर सुसंस्कृत भ्रूण की हालत की जाँच करें. यदि आवश्यक somites की संख्या गिनने के Tyrode खारा में भ्रूण के विकास न्यायाधीश. सामान्य विकास में, एक somite दो घंटे में जोड़ा जाता है.
- जब WEC समाप्त हो गया है, गैस के मिश्रण की आपूर्ति बंद करो और इनलेट ट्यूब और वापस बुदबुदाती बोतल से प्रवेश ट्यूब में प्रवाह से बचने के लिए फिल्टर झिल्ली डिस्कनेक्ट.
7. नोट्स
- WEC प्रणाली के अंदर तापमान लगातार 37.0-37.5 डिग्री सेल्सियस पर रखा है
- 100% चूहे आईसी सीरम नियमित चूहा और माउस भ्रूण के लिए हमारे WEC में प्रयोग किया जाता है, और उपयोग करने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा.
- हम चूहा आईसी सीरम, जो चूहों से एकत्र किया जाता है कि isoflurane साथ anesthetized हैं खरीद.
- प्रयोज्य बोतलों भी Ikemoto Rika से उपलब्ध हैं. बोतलें और सिलिकॉन प्लग autoclaved होना चाहिए.
- भ्रूण के विच्छेदन आरटी पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए क्योंकि विच्छेदन के दौरान कम या उच्च तापमान पर भ्रूण बनाए रखने WEC में बाद में विकास को प्रभावित.
- विच्छेदन के लिए उपकरण सूखी गर्मी से निष्फल रहे हैं.
- त्वचा और पेट की दीवार अलग से कटौती की जानी चाहिए संभव के रूप में एक डिश में बाल के संक्रमण से बचने के लिए. हम उनमें से एक नई जोड़ी के साथ बड़ी कैंची और संदंश की एक जोड़ी बदल जब हम त्वचा में कटौती और गर्भाशय अलग, क्रमशः.
- संदंश जिसका सुझावों ठीक कर रहे हैं का उपयोग करना बहुत महत्वपूर्ण है ऊतकों को निश्चित रूप से काटना. हम मैन्युअल रूप से एक पत्थर और मशीन के तेल के साथ संदंश के सुझावों पैनापन.
- हम भ्रूण करने के लिए अतिरिक्त दबाव से बचने के लिए एक चाकू की तरह संदंश के एक तरफ का उपयोग करें.
- जब बार - बार दरवाजा खोलने के द्वारा WEC प्रणाली के अंदर तापमान कम हो जाती है, हम प्रकाश पर बारी करने के लिए सिस्टम के अंदर तापमान रखने के लिए जारी है.
8. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 चूहा भ्रूण और सभ्य चूहा भ्रूण के विच्छेदन की प्रक्रिया से पता चलता है.
चित्रा 1 E12.5 चूहा भ्रूण के पूरे भ्रूण संस्कृति. (ए) एक conceptus गर्भवती चूहे के गर्भाशय से dissected. नाल पक्ष में (बी) decidua का निकालना. (सी) रीचर्ट झिल्ली के हटाने. (डी) की जर्दी थैली खोलना. (ई) WEC की शुरुआत के बाद 6 घंटे के लिए बोतल में चूहा भ्रूण संवर्धन. (एफ) चूहे भ्रूण 42 घंटा के लिए सुसंस्कृत. घ, decidua, आर, रीचर्ट झिल्ली, पी, नाल, वाईएस, जर्दी थैली, ई, भ्रूण.
| 0 घंटा | 12 घंटा | 24 घंटे | 36 घंटा | 48 घंटा | |
| E12.5 चूहा भ्रूण | 95% 50 सीसी | 95% 75 सीसी (घंटा 10) | 95% 100 सीसी | 95% 125 सीसी (34 घंटा) | 95% 150 सीसी |
तालिका 1 इष्टतम ऑक्सीजन हालत.
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Discussion
कृंतक WEC में सफलता के लिए दो महत्वपूर्ण कदम हैं. सबसे पहले, विच्छेदन की प्रक्रिया नहीं नुकसान भ्रूण, विशेष रूप से रक्त वाहिकाओं के लिए सटीक होना चाहिए. दूसरा, प्रक्रिया जितनी जल्दी संभव हो सकता है क्योंकि ऑक्सीजन और पोषक तत्व नहीं रह रहे हैं गर्भाशय से अलगाव के बाद नाल के माध्यम से आपूर्ति चाहिए. यह पुराने भ्रूण के लिए महत्वपूर्ण है. E12.5 बाद चूहे WEC के मामले में, हम 30 मिनट के भीतर संस्कृति बोतलों में dissected भ्रूण स्थानांतरण चाहिए.
हम जंगली प्रकार और फ्लोरोसेंट रंजक DiI के साथ कोशिकाओं के छोटे संख्या लेबलिंग या जंगली और प्रकार उत्परिवर्ती 7 पृष्ठभूमि चूहे के भ्रूण में DiI - लेबल कोशिकाओं के प्रत्यारोपण द्वारा Pax6 उत्परिवर्ती चूहे भ्रूण में तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के प्रवास पैटर्न का विश्लेषण किया है. पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट के एक भाग्य का नक्शा DiI और के लिए 24 घंटे 8 संवर्धन के साथ neuroepithelial कोशिकाओं लेबलिंग से माउस में तैयार किया गया है. WEC भी E12.5 चूहा भ्रूण के telencephalon प्रवास Pax6 उत्परिवर्ती चूहे 9 में दिखाया गया है दोष में सेल स्वायत्तता की जांच में GFP व्यक्त कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया गया है है. विभिन्न inhibitors संस्कृति के माध्यम से लागू किया जा सकता है संकेत अक्ष और विकास 10, 11 के दौरान सेल चक्र के गठन में शामिल रास्ते की जांच कर सकते हैं. इसके अलावा, हम बस जीन कार्यों 12,13,14 विश्लेषण electroporation द्वारा संवर्धित भ्रूण के दिमाग को विकसित करने में अभिव्यक्ति plasmids और siRNA परिचय कर सकते हैं. हम भी neuroepithelial WEC निम्नलिखित अंग संस्कृति या टुकड़ा संस्कृति में फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल की कोशिकाओं के व्यवहार की जांच (रेफरी देखने के 14 और उसमें संदर्भ.) 14. इसलिए, कृंतक WEC न केवल सेल वंश का विश्लेषण करने के लिए, लेकिन यह भी नुकसान के समारोह और लाभ के समारोह के प्रयोगों द्वारा जीन कार्यों elucidating के लिए बहुत उपयोगी है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम श्री Hajime Ichijo वीडियो संपादन के लिए वीडियो रिकॉर्डिंग और उपयोगी सलाह के लिए धन्यवाद. हम भी वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए तरह सहायक के लिए Drs.Yuji Tsunekawa और Kaichi Yoshizaki धन्यवाद. इस काम के लिए KAKENHI द्वारा युवा वैज्ञानिक बी और प्राथमिकता वाले क्षेत्रों के आण्विक जापान के MEXT से मस्तिष्क विज्ञान पर समर्थित है. हम का समर्थन स्वीकार करते हैं ग्लोबल कार्यक्रम "ग्लोबल मस्तिष्क विज्ञान के लिए बुनियादी और translational अनुसंधान केंद्र" MEXT से और जापान के कोर रिसर्च उद्विकासी विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए (शिखा) जापानी विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (JST) से जापानी विज्ञान और प्रौद्योगिकी निगम से COE .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | - | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott Laboratories | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Merck & Co. | - | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. | ||
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles River Laboratories | - | |
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any Supplier | - | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | BD Biosciences | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles River Laboratories | - | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | Made by hand using Pasteur pipette. | ||
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica Microsystems | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica Microsystems | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
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