Summary
Hela embryo kultur tekniken tillåter oss att kultur mus och embryon råtta
Abstract
Hela embryo kultur (WEC) tekniken har utvecklats i 1950-talet av nya och hans kollegor, och ansökte om utvecklingsbiologi 1. Även utveckling och tillväxt av däggdjur embryon är mycket beroende på funktionen av moderkakan, gör att WEC tekniken oss att kultur mus och embryon råtta ex vivo tillstånd under begränsade perioder motsvarande midgestation steg under embryonala dag (E) 6,5-E12.5 i mus eller E8.5-E14.5 hos råtta 2, 3, 4. I WEC, vi kan inriktas direkt på önskade områden av embryon med hjälp av fina glas kapillärer eftersom embryon kan manipuleras under mikroskop. Därför är gnagare WEC mycket användbar teknik när vi vill studera dynamiska utvecklingsprocesser av postimplanted däggdjur embryon. Hittills har flera olika typer av WEC system utvecklats 1. Bland dessa är rotator-typ flaska kultur systemet mest populära och lämpliga för långtidsodling av embryon vid midgestation, dvs efter E9.5 och E11.5 i mus och råtta, respektive 1. I den här videon protokoll, visar vi vår standard förfaranden råtta WEC efter E12.5 med en förfinad modell av den ursprungliga rotator, som ritades av nya och Cockroft 5, 6, och införa olika tillämpningar av WEC teknik för studier i däggdjur utveckling biologi.
Protocol
1. Ställa in WEC-systemet
- Gemensam ett 0,22 ìm membranfilter till inloppet kisel röret i WEC systemet en).
- Öppna ventilen till en gasflaska med O 2 (95%) och CO 2 (5%). Flow gasblandningen in i trumman via bubblande flaska innehåller autoklaveras vatten.
- Justera flödet volym gasblandningen 50 cc.
- Sätt ut låt kisel röret i en vattenflaska och kolla flödet av gasblandning.
- Rotera trumman med en hastighet av 20 varv / min.
2. Beredning av odlingsmedium
- Tina råtta omedelbart-centrifugeras (IC) i serum på 37,0 ° C b). Lägg till D-glukos (2 mg / ml) i tinat serum i en autoklaveras 100 ml bägare. Odlingsmedium bör förberedas på den primära kulturen nivå (t.ex. med hjälp av en huva).
- Lägg till antibiotika-antimykotika (100X) vätskan serum med 1: 400 utspädning.
- Förgasas återstående isofluran (på grund av anestesi hos råttor under samla blod) från serum i 20 minuter i rumstemperatur (RT) c).
- Sterilisera substratet med hjälp av en 0,45-filter ìm membran.
- Häll 3,0 ml av mediet i varje kultur flaskan och försegla upp på varje flaska med en kisel-kontakt, täckt med aluminiumfolie (se ref. 14) d).
- Förbered tre eller fyra rätter förfogande Petri innehåller Tyrode är saltlösning e).
3. Anestesi av råtta och isolering av livmodern
- Bedöva en tidsinställd gravida råttor djupt med inhalationsanestetika eller parenterala bedövningsmedel.
- Rengör buken av sövda dräktig råtta med 70% etanol.
- Plocka upp huden med pincett och exteriorize bukväggen genom att skära i huden med stora saxar f).
- Plocka upp bukväggen med en pincett och göra U-formade stora längsgående snitt på bukväggen med stora sax upp till bröst-nivå g).
- Bear bort tarmen på vänster sida med en pincett och utsätter den ena änden av livmodern är ansluten till äggstockarna.
- Plocka upp i slutet av livmodern med en pincett och skär position mellan livmodern och äggstockarna med stor sax.
- Ta ut livmodern från den gravida råttan genom att skära fettet runt livmodern tills den andra änden av livmodern.
- Överför livmodern att en petriskål med Tyrode är saltlösning.
- Euthanize råttan av överdriven användning av anestetika eller halsdislokation efter borttagning av livmodern.
4. Borttagning av embryon från livmodern
- Kortfattat skölja livmodern i Tyrode är saltlösning och överföra den till den andra petriskål med ett par fina pincett h).
- Enligt en kikare mikroskop, plocka upp livmoderväggen med ett par fina tång och skär livmoderväggen på motsatta sidan mesometrium ansluta med blodkärl med hjälp av ögondroppar rak sax.
- För in spetsen på oftalmologiska raka sax i utrymmet mellan livmoder väggen och decidua. Skär livmoderväggen longitudinellt längs antimesometrial sida.
- Klumpar i decidua vid mesometrial sidan och separat conceptuses från livmodern med hjälp av två par fina pincett i).
- Överför conceptuses till den tredje petriskål med en steriliserad glaspipett med lämplig diameter.
5. Dissektion av råtta embryon
- Sätt en spets microforceps i decidua och göra en tvärgående snitt på decidua runt Conceptus med två par pincett.
- Sätt in tips om pincetten i decidua vid placental sidan och gör två längsgående snitt på decidua till toppen.
- Ta bort decidua vid moderkakan sida genom att slita ut det med två par pincett. Ta bort återstående decidua med två par pincett.
- Plocka upp Reichert membran, gör ett horisontellt snitt på det, och separera membran från Conceptus vid anti-placenta-sida.
- Gör ett litet hål på gulesäcken nära chefen för embryot med två par tång, och skär gulesäcken med ett par oftalmologiska böjd sax. Det är viktigt att inte skada större blodkärl.
- Plocka upp amnion på platsen runt huvudet av embryot med två par fina tång och försiktigt dra ut embryot från gulesäcken genom att riva amnion h). Kroppen av embryo skall dras ut från gulesäcken att öka tillgången på syre för embryot vid midgestation skede.
6. Hela embryo kultur
- Kontrollera skador på moderkakan, gulesäcken, och tillståndet av att hjärtat slår och blodcirkulation.
- Att vara medveten om inte stretching navelsträngen, överföringembryot till en kultur flaska med en steriliserad glaspipett. Överföring av Tyrode s koksaltlösning till kultur flaskor bör vara så lite som möjligt.
- Ta bort en icke-håls kisel kontakten ur rotator trumman. Anslut kulturen flaskan med en kontakt med ett hål till rotatorn trumman i WEC systemet vinkelrätt. Var noga med att inte lägga kraft på trumman i olämpliga riktningar eftersom rotatorn trumman är en mycket fin utrustning. Flaskorna innehåller dissekerade embryot överförs till kultur en efter en, öppnas dörren av kuvösen bör minimeras för att undvika att temperaturen på inkubatorn minskas j).
- Efter 10 h av kultur, öka flödet gasvolym blandning upp till 75 cc och upp till 100 cc efter 24 tim (tabell 1).
- Odlingsmediet bör bytas ca 24 tim genom att överföra de odlade embryot till en ny kultur flaska med nygjord medium. Öka flödet volym upp till 125 cc efter 34 tim och upp till 150 cc efter 48 tim (tabell 1)
- Ibland kontrollera tillståndet för de odlade embryon genom att räkna hjärtslag (dvs, 120-150/min är optimalt) och genom att observera blodcirkulationen. Vid behov räkna antalet somites att bedöma tillväxten av embryon i Tyrode är koksaltlösning. I normala utveckling är en somit läggas till i två timmar.
- När WEC är klar, stoppa leverans av gas blandning och koppla inloppet röret och membranfilter för att undvika tillbaka flöda in i inloppet röret från porlande flaskan.
7. Anteckningar
- Temperaturen inne i WEC är ständigt hålls på 37,0-37,5 ° C.
- 100% råtta IC serum rutinmässigt används i våra WEC för råtta och mus embryon, och förvaras vid -20 ° C före användning.
- Vi köper råtta IC serum, som samlas in från råttor som är sövda med isofluran.
- Disponibel flaskor finns också tillgängliga från Ikemoto Rika. Flaskor och pluggar kisel skall autoklaveras.
- Dissektion av embryon skall utföras vid RT eftersom upprätthållandet av embryon vid låg eller hög temperatur under dissektionen påverka efterföljande utvecklingen i WEC.
- Verktyg för dissektion är steriliserade med torr värme.
- Huden och bukväggen bör minskas separat för att undvika kontaminering av hårstrån i en skål som möjligt. Vi byter ett par stora sax och pincett med ett nytt par av dem när vi skära in i huden och isolera livmodern, respektive.
- Använd pincett vars tips är bra är mycket viktigt att dissekera vävnader säkert. Vi vässar manuellt tips av pincetten med en sten och maskin olja.
- Vi använder ena sidan av tång som en kniv för att undvika övertryck på embryon.
- När temperaturen inne i WEC systemet minskar genom att öppna dörren gång på gång fortsätter vi att slå på ljuset för att hålla temperaturen inne i systemet.
8. Representativa resultat
Figur 1 visar förfaranden dissektion av råtta embryot och odlade embryon råtta.
Figur 1. Hela embryo kultur E12.5 råtta embryot. (A) en Conceptus dissekerat från livmodern på gravida råttor. (B) avlägsnande av decidua vid moderkakan sida. (C) Borttagning av Reichert membran. (D) Öppna gulesäcken. (E) Råttan embryot odling i flaskan för 6 tim efter början av WEC. (F) Råttan embryot odlade för 42 tim. D, decidua, R, Reichert membran, p, moderkakan, ys, gulesäcken, e, embryo.
| 0 tim | 12 tim | 24 tim | 36 tim | 48 tim | |
| E12.5 råtta embryo | 95% 50 cc | 95% 75 cc (10 tim) | 95% 100 cc | 95% 125 cc (34 tim) | 95% 150 cc |
Tabell 1. Optimal syre skick.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns två viktiga steg i gnagare WEC för framgången. Första bör dissektion förfarandet vara korrekt att inte skada embryon, speciellt blodkärl. För det andra bör förfarandet så snabbt som möjligt eftersom syre och näringsämnen inte längre levereras via moderkakan efter isolering från livmodern. Detta är avgörande för äldre embryon. I fråga om råttan WEC efter E12.5, bör vi föra dissekeras embryon i kulturen flaskor inom 30 minuter.
Vi har analyserat flyttmönster neurallist celler i den vilda typen och Pax6 mutant embryon råtta märkning litet antal celler med fluorescerande färg DII eller transplantera DII-märkta celler i råtta embryon av vildtyp och mutant bakgrund 7. En öde karta över främre neurala plattan har upprättats i musen från märkning neuroepiteliala celler med DII och odling för 24 tim 8. WEC har också använts för transplantation av celler som uttrycker GFP i telencephalon av E12.5 råtta embryon att undersöka cell autonomi i migration defekter som visas i Pax6 muterade råttan 9. Olika hämmare kan appliceras på odlingsmediet att undersöka signalvägar involverade i axel bildning och cellcykeln under utveckling 10, 11. Dessutom kan vi presentera helt enkelt uttryck plasmider och siRNA på att utveckla hjärnan hos odlade embryon genom elektroporation att analysera genfunktioner 12,13,14. Vi undersökte också beteendet hos neuroepiteliala celler märkta med fluorescerande protein i orgel kultur eller slice kultur efter WEC (se ref. 14 och referenser däri) 14. Därför är gnagare WEC mycket användbar inte bara för att analysera cellsläktträd men också för att belysa genfunktioner av förlust-av-funktion och få-av-funktionen experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Mr Hajime Ichijo för video-inspelning och hjälpsamma råd för redigering av video. Vi tackar också Drs.Yuji Tsunekawa och Kaichi Yoshizaki för slags assistent för video-inspelning. Detta arbete stöds av KAKENHI på unga forskare B och på prioriterade områden, Molecular Brain Science från MEXT av Japan. Vi erkänner stöd för globala COE-programmet "Grundläggande och translationell forskning Center for Global Brain Science" från MEXT i Japan och kärnan forskning för EVOLUTIONS-vetenskap och teknik (CREST) från japanska vetenskaps-och Technology Corporation från japanska vetenskap och teknik Agency (JST) .
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| WEC system (10-0310) | Tool | Ikemoto Rika | 010-0310 | Another small model is also available. |
| Silicon plug without a hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-08 | |
| Gas mixture cylinder | Tool | Nikko Sanso | - | Containing 95% oxygen & 5% carbon dioxide. Custom order. |
| Gas regulator | Tool | Ono Seisakusho | WR-11 | |
| 0.22 μm filter Millex GS | Tool | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| Large scissors | Tool | Napox | B-7H | |
| Forceps | Tool | Napox | A-3-2 | |
| Disposal Petri dish (90 mm x 15 mm) | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | SH90-15 | Deep-type dish is the best for dissection. |
| Isoflurane | Reagent | Abbott Laboratories | B506 | For anesthesia |
| Pentobarbital sodium | Reagent | Merck & Co. | - | For anesthesia |
| Tyrode’s saline | Reagent | According as the protocol in Ref. 2. Save at 4°C. | ||
| Timed-pregnant Sprague-Dawley rat | Animal | Charles River Laboratories | - | |
| Culture glass bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-05 | |
| Disposal culture bottle | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-06 | |
| Silicon plug with hole | Tool | Ikemoto Rika | 010-032-07 | |
| Aluminum foil | Tool | Any Supplier | - | |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-26 | For culture bottles |
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-14A | For silicon plugs |
| 0.45 μm filter Millex HA | Tool | EMD Millipore | SLHA033SS | |
| 50 ml conical tube | Tool | BD Biosciences | 352070 | |
| 100 ml beaker | Tool | Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. | TE-32 | |
| Rat IC serum | Reagent | Charles River Laboratories | - | Refer to: Mr. Kunihiko Morisaki, TEL: +81-(0) 45-474-9336; FAX: +81-(0) 45-474-9340 |
| D(+)-Glucose | Reagent | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| Antibiotic-antimyotic liquid | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15240 | |
| Ophthalmic straight scissors | Tool | Napox | MB50-7 | For cutting the uterine wall |
| Ophthalmic curved scissors | Tool | Napox | MB54-2 | For cutting the yolk sac |
| Forceps #5 | Tool | Vigor | T6715 | |
| Forceps #5F | Tool | Regine | T6819 | |
| Glass pipette | Tool | Made by hand using Pasteur pipette. | ||
| Autoclaving bag | Tool | Hogy | HM-4 | For glass pipettes |
| Binocular microscope | Tool | Leica Microsystems | Mz7s | |
| Light | Tool | Leica Microsystems | CLS 150XD | |
| Oil stone | Tool | Uchida Yoko | 833-2000 | For sharpening of forceps |
| Machine oil | Tool | Uchida Yoko | 835-0000 | For sharpening of forceps |
References
- New, D. A. T. Intoroduction. In mammalian postimplantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 1-14 (1990).
- Cockroft, D. L. Dissection and culture of post implantation embryos. In Mammalian Postimplantation Embryos A Practical Approach. Copp, A. J., Cockroft, D. L. , IRL Press. Oxford. 15-40 (1990).
- Morris-Kay, G. M.
- Fujinaga, M. In vitro culture of rodent embryos during the early postimplantation period. Developmental Biology Protocols. Tuan, R. S., Lo, C. W. , Humana Press. Totowa. 53-76 (2000).
- Eto, K., Takakubo, F. Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis. J. Craniofac. Genet. Dev. Biol. 5, 351-355 (1985).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Osumi-Yamashita, N., Ninomiya, Y., Eto, K.
- Inoue, T., Nakamura, S., Osumi, N. Fate mapping of the mouse prosencephalic neural plate. Dev. Biol. 219, 373-383 (2000).
- Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5. Development. 133, 1335-1345 (2006).
- Inoue, Y. U., Asami, J., Inoue, T. Genetic labeling of mouse rhombomeres by Cadherin-6::EGFP-BAC transgenesis underscores the role of cadherins in hindbrain compartmentalization. Neurosci. Res. 63, 2-9 (2009).
- Calegari, F., Huttner, W. B. An inhibition of cyclin-dependent kinases that lengthens, but does not arrest, neuroepithelial cell cycle induces premature neurogenesis. J. Cell Sci. 116, 4947-4955 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Arai, Y. Role of Fabp7, a downstream gene of Pax6, in the maintenance of neuroepithelial cells during early embryonic development of the rat cortex. J. Neurosci. 25, 9752-9761 (2005).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 485-497 (2008).
