Summary
Böcekler, oenocytes cuticular hidrokarbon bileşikleri üretir. Bu bileşikler kuruma karşı korumak ve kimyasal iletişimi kolaylaştırmak. Burada yetişkin oenocytes izole etmek için kullanılan bir diseksiyon tekniği göstermek
Abstract
Içinde
Protocol
Bölüm 1. Yetişkin Drosophila karın Fileto hazırlanması.
Bu prosedür ana hatlarıyla aşağıdaki oenocytes (protokol Part2) sonradan giderilmesi için acil karın hazırlar. Dorsal damar (yani kalp) ve yağ vücut manikür iç yüzeyine bağlı diğer dokularda, hazırlanması için de aynı prosedür kullanılabilir.
Video makalede oenocyte diseksiyon tekniği yetişkin bir wild-tip (Canton-S) erkek sinek yaş altı gün gösterdiği olduğunu unutmayın. Özdeş teknikleri erkek sineklerin oenocytes kaldırmak için kullanılabilir. Karın fileto hazırlama gerçekleştirmek için yaklaşık 5 dakika sürer.
Başlamadan önce hazır birkaç ince diseksiyon pimleri (aşağıya bakınız Bölüm 2) ve bir diseksiyon iğnesi (bkz. Bölüm 2) olması önemlidir. Ticari olarak mevcut diseksiyonu iğnelenme, bu protokol için sık çok büyük, bu yüzden biz laboratuvarda kendi imalatı almış. Diseksiyon iğnesi oluşturmak için, tungsten tel (0.005 ") ilk derialtı iğne mili (27G, alüminyum hub) ile dişli Konu tel derialtı iğne ucu ile göbek çıkar, böylece çıkıntılı tel kıvırın. hub derialtı iğne çıkardı tel engeller Sonraki tel, tel birkaç milimetre (yaklaşık 3-4mm) derialtı iğne ucu dışarıya kıvrımlı ucunu kesip Passing. ucu bir alev ile maruz tungsten tel çok ince bir nokta netleştirmek derialtı iğne hub'a sıkışmış tek 5ml plastik pipet Bu diseksiyon aracı için uygun sap gibi davranır ince diseksiyon pimleri benzer bir yapılır. yolu. keskinleştirme adımdan sonra, hareket etmesini önlemek ve küçük diseksiyon pin serbest ucu kesilmiş yaklaşık 3mm yapmak için, forseps ile sıkıca tel çok uç kavrayın. kavramak, fırlattı olmaktan pin önlemek için dikkatli olun forseps.
Fileto için yetişkin Drosophila karın hazırlar:
- Toraks rağmen iyi bir diseksiyon pin koyarak; diseksiyon plaka (Dow Corning Sylgard) sinek sabitleyin.
- Sineğin bacaklarını ve kanatlarını çıkartın. Bacakların en arka çıkarırken, toraks, karın birleştiği yerde sadece ön noktada manikür bir açılış oluşturun. Bu açılış (Adım 5) daha sonra ventral karın yüzeyi boyunca bir kesi yapmak için bir erişim noktası olarak kullanılır.
- Genital segment üzerinden ikinci bir diseksiyon pimi koyarak yerde sinek karın sabitleyin.
- Kapak soğutulmuş Shields ile sinek ve M3 böcek orta (Sigma) Sang. Pasteur pipeti ile kapalı çekerek sıkışan havayı çıkarın.
- Forseps kullanarak genital segment için bacaklarını kaldırarak oluşturulan manikür açılış ventral orta hat boyunca bir kesi yaparak karın açın. Karın cesareti ve gonadlar çıkarın.
- Toraks karın bağlayan manikür ve trakea Sever. Toraks karın bağlayan tek kalan doku kalp olmalıdır. Bu, bazı istikrar ile karın manikür sağlar ve bir sonraki adıma sırasında döndürme veya büküm önler.
- Karın manikür en ön köşeleri düz pin. Toraks çıkarın. Manikür manikür gergin, pin düz arka köşeleri Çekme. Genital segmentinde, manikür düz koymak yapmak için pin repositioned gerekebilir.
Bölüm 2. Oenocyte diseksiyonu
Karın fileto hazırlama, karın manikür ve bağlı dokular da dahil olmak üzere, kalp, yağ vücut, trakea, vücut duvarı kasları, epidermis ve oenocytes iç yüzeyi ortaya çıkarır. Kalp dorsal orta hat boyunca uzanan. Yağ vücudun iç cuticular yüzeyi (opak doku) kapsıyor. Trakea lateral solungaç yarığı açıklıkları (beyaz tübüler yapılar) genişletmek ve bu dokuların sızmak geniş dalları yapmak. Pigmentli oenocytes (amber renkli hücreleri), orta hat posterior bölgede her segmentin manikür lateral kenarına kadar yayılabilir, bu dokuların altında yatıyor. Oenocytes her tergite (dorsal cuticular levhaları) koyu tabaklanmış bölgelerde altında yalan ve onların yerini önceden bilgi sahibi olmadan tespit etmek zor olabilir. Ventral bulunan oenocytes başka bir nüfusa sternites (ventral cuticular plakaları) ile ilişkilidir; bu hücrelerin izole etmek mümkün olsa da, bu video protokolü sadece dorsal oenocytes diseksiyonu gösterecektir. Her karın segmentinde, yağ vücut dokusu belirgin bir yaprak oenocytes ön yatıyor; yağ vücudun daha az belirgin küçük bir yaprak oenocytes posterior yatıyor. Yağ vücut dokusu önde gelen yaprak genellikle oenocyte kapsarönceki segment var. Dorsal damar ve yağ vücut oenocytes göstermek için ilk önce kaldırılması gerekir.
Unutulmaması gereken önemli olduğunu, kendi adını türediği oenocytes sarı pigmentasyon (Oeno - Yunan oînos, 'şarap') 1, açıkça çevreleyen dokular, bu hücrelerin ayırt pigmentasyon yoğunluğu yaşla birlikte artar sineğin. Ayrıca, bazal lamina, hücre kümeleri için destek sağlayan ve diseksiyonu sırasında ayrışmış olma hücreleri engelleyen, oenocytes 2,3 ensheathes . Bazal lamina da bu yapışıklıklar kolay bozulacak bir zayıf nokta oluşturarak, extraneously yapıştırılır dokuların uzaklaştırılması, yağ vücut dokusu gibi yardımcı olur.
Aşağıda belirtilen yöntemle karın kabuklarıyla oenocytes kaldırılması için ayrıntılı talimatları sağlar. Oenocytes karın segmentleri 2-5 (erkek) ve 2-6 (dişi) kolayca çıkartılabilir. Ilk ve son karın kesimleri (segmentleri 1 ve 6 ya da erkeklerde kadınlarda 7) oenocytes sık sık manikür köşeleri tutan diseksiyon pimleri ile bozulduğu ve bu nedenle kaçınılmalıdır. Oenocytes kaldırılması gerçekleştirmek için yaklaşık 10 dakika sürer.
Yetişkin oenocytes izole etmek için:
- Diseksiyonu iğne kullanılarak spiracles kaynaklanan trakeal gövdelerine Sever.
- Diseksiyonu iğne ile manikür iç yüzeyi bağlantılarının kesilmesinin yağlı vücut ve kalp çıkarın. Bunu yapmak için, yağ vücut ve oenocytes arasındaki diseksiyon iğne nokta konum ve kalp altındaki, hareketli ve orta hatta kadar, karşı tarafında devam manikür lateral kenarına sürükleyin. Anterior posterior Devam eden, birbirini izleyen her segmentin manikür yağ vücut doku ve kalp çıkarın. Dikkatli yapılması durumunda oenocytes manikür bağlı kalır ve yağ kalbin ve vücudun tüm silinebilir.
- Vücut duvarı kasları kayışı oenocytes manikür iç yüzeyi. Diseksiyon iğnesi kullanarak, her segmentin boyuna vücut duvarı kasları sever. Bunu yapmak için, manikür yüzeyine hafifçe kaldırarak, oenocyte iplikli arka tarafı boyunca diseksiyon iğnesi sürükleyin. Şerit gibi oenocyte ipliklerini manikür uzak gelmeli ve kalan oenocytes kaldırılır yan döşenebilir.
- Manikür çıkarılır ve diseksiyon plaka üzerinde yatarken onu temizlemek için gerekli olabilecek herhangi bir oenocytes yağ vücut dokusu yapıştırılır. Bu yağ vücut doku ve oenocytes arasında diseksiyonu iğne yerleştirerek, sadece ve iğne aşağı ve diseksiyon plaka karşı iterek bağlantı kesilmesinin tarafından yapılır.
- Diseksiyon iğne ucu ile sadece onları alay oenocyte ipliklerini toplayın. Bir kez oenocytes kültür ortamı yüzeyi boyunca yavaş yavaş çekilebilir diseksiyon iğne sonuna kadar sıkışmış. Disseke oenocytes, RNA ve protein izolasyonu için uygun hücre lizis tamponu doğrudan yerleştirilebilir. Tek bir erkek sinek oenocytes (karın segmentleri 2-5) total RNA genellikle 15-20ng verimleri.
Şekil Yetkiler:
Şekil 1. D. erkek ve kadın oenocytes desaturaz genler, desat1 ve desatF, Açıklanması melanogaster yetişkin erkek ve kadın oenocytes türetilen cDNA desat1 ve desatF ters transkripsiyon-PCR. Desat1 geni, hem de erkek ve kadın oenocytes olarak ifade edilir; desatF ifadesi sadece kadın oenocytes ifade ediliyor, cinsel dimorfik . Desat1 gen ekspresyonu bu farklılıklar karşılık gelen, erkek ve kadın 9 hem ortak, hidrokarbon türevi bileşiklerin üretimi için gereklidir ve desatF kadın özel hidrokarbon bileşikleri 10,11 üretimi yer almaktadır. DesatF özellikle ifade edilmesi gösterilmiştir in situ hibridizasyon 12 kadın oenocytes. Ortalama toplam RNA 15-20ng bireysel bir sinek disseke oenocytes elde olduğunu unutmayın. RNA RNeasy mikro kiti (Qiagen) kullanılarak izole edilmiştir; cDNA qScript cDND sentezi kiti (Quanta BioSciences) kullanılarak üretildi
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu video makalede yetişkin oenocytes hazırlanması için ayrıntılı bir diseksiyon protokolü mevcut D. moleküler analiz için uygun bir şekilde melanogaster. Başka bir yerde 2 kısaltılmış bir metin tabanlı hesabı diseksiyon yöntemi tarif edilmiştir, ve oenocyte hazırlık, hem de RNA ve protein 2 ekstraksiyonu için uygun kanıtlanmıştır . Bu preparatın kullanılması, aynı zamanda kültür eksplante oenocytes için yöntemler geliştirmek mümkün olabilir. Oenocyte eksplant kültürü için bir protokol cuticular hidrokarbonların kimyasal maddelerin sentez ve salgılar, bu hücrelerin özerk metabolik kapasitesi belirlenmesine yönelik incelemeler yardımcı olur. Ile birlikte bu teknikler oenocytes hedeflenen genetik manipülasyon izin veren son zamanlarda geliştirilmiş Gal4 oenocyte-line 4, yetişkin meyve sineği oenocyte işlevi ayrıntılı moleküler genetik analiz için izin verecektir.
Oenocyte hücreleri hem larva ve ergin sinek bulunur. Bu hücrelerin birçok morfolojik ve ultrastrüktürel benzerlikleri paylaşmakla birlikte, erişkin sinek oenocytes 5 larva aşamaları sırasında embriyonik gelişim sırasında ayırt etmek ve var olduğunu gelişimsel olarak farklı olduğunu not etmek önemlidir. Yetişkin oenocytes pupa devresi süresince de novo şekillendirme ve 7 yetişkin yaşamda ilk haftasında sayısındaki artış devam histoblasts 6 elde edilecek bildirilmiştir. Yetişkin meyve sineği oenocytes cuticular hidrokarbonlar 4 üretim için gerekli iken, larva oenocytes benzer bir işlevi destek belirlenecek kalır. Aynı şekilde, larva oenocytes, lipid metabolizması 8 ile ilgili hepatosit gibi fonksiyonları korumak; benzer bir rol yetişkin oenocytes için henüz gösterilmemiştir . Hazırlık larva ve yetişkin oenocytes işlevsel benzer derecesinin belirlenmesine yönelik incelemeler yardımcı olacaktır gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz ona yardım için bu video makalenin filme Amsale Belay teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma CIHR, NSERC ve CRC JDL için hibe tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
- Wielowiejski, H. Ueber das blutgewebe der insekten. Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 Forthcoming.
- Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).
- Locke, M. Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems. Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).
- Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
- Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes. J. Anat. 199, 25-33 (2001).
- Lawrence, P. A., Johnston, P. Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles. J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).
- Johnson, M. B., Butterworth, F. M. Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry. J. Morphol. 184, 51-59 (1985).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445, 275-280 (2007).
- Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones. Genetics. 171, 1617-1628 (2005).
- Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).
- Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila. Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).
