Summary
في الحشرات ، وإنتاج مركبات الهيدروكربونية oenocytes جليدية. هذه المركبات تحمي من الجفاف وتسهيل الاتصالات الكيميائية. هنا نظهر تقنية التشريح المستخدمة لعزل oenocytes من الكبار
Abstract
في
Protocol
الجزء 1. فيليه إعداد البطن ذبابة الفاكهة الكبار.
المبينة أدناه إجراءات فورية يعد البطن لإزالة لاحقة من oenocytes (انظر Part2 من البروتوكول). يمكن أيضا أن تستخدم نفس الإجراء لإعداد الأنسجة الأخرى التي تعلق على السطح الداخلي للبشرة ، بما في ذلك سفينة الظهرية (أي القلب) والدهون في الجسم.
علما أنه في المادة الفيديو أظهر تشريح تقنية oenocyte على ذبابة الكبار (كانتون - S) من النوع البري من الذكور ، وستة أيام من العمر. ويمكن استخدام تقنيات مماثلة لإزالة oenocytes من الذباب الإناث. إعداد شرائح البطن يأخذ حوالي 5 دقائق لأداء.
قبل بداية فإنه من المهم أن يكون على استعداد العديد من دبابيس تشريح غرامة (أنظر أدناه والجزء 2) وإبرة تشريح (انظر الجزء 2). دبابيس تشريح المتاحة تجاريا والإبر غالبا ما تكون كبيرة جدا لهذا البروتوكول ، لذا يتعين علينا اتخاذها لافتعال منطقتنا في المختبر. هي الخيوط الأولى لإنشاء إبرة تشريح سلك التنغستن ، (0.005 ") من خلال رمح إبرة تحت الجلد (27G ، والألمنيوم محور). الموضوع سلك طريق رأس الإبرة تحت الجلد بحيث يخرج من محور. إعقص السلك جاحظ من محور ، وهذا يمنع من أن الأسلاك انسحبت من إبرة تحت الجلد وبعد ذلك ، قطع الاسلاك في الطرف المقابل من هذا القبيل أن تجعيد عدة مليمترات (~ 3 - 4mm) من الأسلاك تبرز من طرف الإبرة تحت الجلد يمر. وغيض من التنغستن يتعرض من خلال شحذ اللهب السلك إلى نقطة دقيقة جدا. 5ml من البلاستيك القابل للتصرف ماصة عندما أقحم في محور الإبرة تحت الجلد بمثابة مناسبة لمعالجة هذه الأداة تشريح. دبابيس مصنوعة في تشريح غرامة مماثلة الطريقة ، وبعد الخطوة شحذ ، فهم الطرف جدا من السلك بحزم مع ملقط لمنعه من التحرك واجراء خفض 3mm تقريبا من رأس دبوس للافراج عن تشريح الصغيرة. استخدم الرعاية لمنع طرف من كونها نائية من قبضة الملقط.
لتحضير شرائح البطن ذبابة الفاكهة الكبار :
- تأمين سفر إلى لوحة تشريح (Sylgard ؛ داو كورننغ) عن طريق وضع دبوس تشريح غرامة على الرغم من أن القفص الصدري.
- إزالة أرجل وأجنحة للطيران. في حين إزالة المجموعة الأكثر الخلفي من الساقين ، وخلق فتحة في إهاب عند النقطة الأمامية فقط إلى حيث يلتقي الصدر البطن. ويستخدم هذا الافتتاح في وقت لاحق بوصفه نقطة وصول لإجراء شق على طول السطح البطني من البطن (انظر الخطوة 5)
- تأمين بطن الذبابة في مكان عن طريق وضع دبوس تشريح الجزء الثاني من خلال الأعضاء التناسلية.
- تغطية يطير مع شيلدز المبردة وسانغ M3 المتوسطة الحشرات (سيغما). إزالة أي الهواء المحبوس عن طريق رسم تشغيله مع ماصة باستور.
- ملقط باستخدام فتح البطن عن طريق شق بطني على طول خط الوسط من فتح في إهاب إنشاؤها عن طريق إزالة الساقين إلى الجزء التناسلية. إزالة الغدد التناسلية من الشجاعة والبطن.
- قطع جليدة والقصبات الهوائية التي تربط البطن إلى القفص الصدري. ينبغي للنسيج الوحيد المتبقي الذي يربط البطن إلى الصدر أن يكون القلب. وهذا يوفر للبشرة البطن مع بعض الاستقرار ، ويمنعها من الدورية أو التواء في الخطوة التالية.
- دبوس شقة الزوايا الأكثر الأمامي للبشرة البطن. إزالة القفص الصدري. شد بشرة ، دبوس مشدود شقة الزوايا الخلفية للبشرة. قد يعلقون في الجزء الأعضاء التناسلية يجب أن يتم تعديل أوضاعها لجعل بشرة وضع مسطح.
الجزء 2. Oenocyte تشريح
إعداد شرائح البطن يعرض السطح الداخلي للبشرة البطن والأنسجة تعلق بما في ذلك القلب والدهون في الجسم ، الرغامى ، عضلات جدار الجسم ، والبشرة ، وعلى oenocytes. قلب تقع على طول خط الوسط الظهرية. الدهون في الجسم (الأنسجة كامد) تغطي معظم سطح جليدية داخلية. الرغامى (هياكل أنبوبية بيضاء) تمتد من الفتحات الجانبية منتفس ، وجعل الفروع الواسعة التي تتسلل هذه الأنسجة. الكذب تحت هذه الأنسجة ، وoenocytes المصطبغة (بلون الكهرمان الخلايا) تشع من خط الوسط إلى الحافة الجانبية للبشرة في المنطقة الخلفية من كل قطعة. وتقع مباشرة تحت oenocytes المناطق المدبوغة بحزن كل tergite (لوحات جليدية الظهرية) ، ويمكن أن يكون من الصعب تحديد من دون معرفة مسبقة من موقعهم. ويرتبط سكان oenocytes آخر يقع ventrally مع sternites (لوحات جليدية بطني) ، على الرغم من أنه من الممكن عزل هذه الخلايا ، وهذا البروتوكول الفيديو سوف تظهر فقط تشريح oenocytes الظهرية. كل قطعة في البطن ، ورقة بارزة من أنسجة الجسم من الدهون تكمن الأمامي إلى oenocytes ؛ أصغر ورقة أقل وضوحا من الدهون في الجسم تكمن الخلفية لoenocytes. ورقة بارزة من أنسجة الجسم من الدهون غالبا ما يغطي oenocyteق الجزء السابق عليه. يجب إزالة السفينة الظهرية والدهون في الجسم أولا من أجل فضح oenocytes.
ومن المهم أن نلاحظ أن تصبغ العنبر من oenocytes ، والتي من اسمها مستمد (أوينو -- من oînos اليونانية ، "النبيذ') 1 ، ويميز بوضوح هذه الخلايا من الأنسجة المحيطة بها ، وكثافة تصبغ تزداد مع العمر ليطير. وعلاوة على ذلك ، والصفيحة القاعدية للensheathes oenocytes 2،3 ، وتوفير الدعم للمجموعات الخلية ومنع الخلايا من ان تصبح فصلها أثناء تشريح. على الصفيحة القاعدية تساعد أيضا في إزالة أنسجة انضمت غيره ، مثل أنسجة الجسم الدهون ، من خلال إنشاء نقطة الضعف التي يمكن أن تكون هذه الالتصاقات الإخلال بها بسهولة.
الإجراء المذكورة أدناه يقدم تعليمات مفصلة لإزالة oenocytes من إهاب البطن. يمكن أن تكون oenocytes إزالتها بسهولة من شرائح البطن 2-5 (الذكور) ، و 2-6 (أنثى). كثيرا ما تتعطل oenocytes من شرائح البطن الأول والأخير (شرائح 1 ، و 6 في الذكور أو الإناث في 7) بواسطة المسامير تشريح عقد زوايا إهاب وبالتالي يتم تجنب. إزالة oenocytes يستغرق حوالي 10 دقيقة للتنفيذ.
لعزل oenocytes الكبار :
- قطع جذوع القصبة الهوائية المنبثقة من spiracles باستخدام إبرة تشريح.
- إزالة الدهون في الجسم والقلب بقطع الاتصالات على السطح الداخلي للبشرة مع إبرة تشريح. للقيام بذلك ، ضع نقطة من إبرة تشريح بين الدهون في الجسم وoenocytes ، واسحبه من الحافة الجانبية للبشرة ، وصولا إلى خط الوسط ، يتحرك تحت القلب ، والاستمرار في الجانب المعاكس. تتقدم من الخلف إلى الأمام ، وإزالة أنسجة الجسم من الدهون والقلب من كل قطعة من إهاب المتعاقبة. إذا أجريت بعناية oenocytes تظل تعلق على بشرة ، ويمكن إزالة الدهون في الجسم والقلب كله.
- رباط الجسم عضلات جدار oenocytes إلى السطح الداخلي للبشرة. باستخدام إبرة تشريح قطع طولية عضلات جدار الجسم من كل قطعة. للقيام بذلك ، اسحب الإبرة تشريح على طول الجانب الخلفي من oenocyte حبلا ، ورفع لهم بلطف من سطح بشرة. ينبغي للفروع الشريط مثل oenocyte يأتي بعيدا عن بشرة ، ويمكن أن تكون وضعت على الجانب بينما يتم إزالة oenocytes المتبقية.
- إزالة مرة واحدة من إهاب والكذب على لوحة التشريح أنه قد يكون من الضروري تنظيف إيقاف أي انضمت الى أنسجة الجسم من الدهون oenocytes. يتم ذلك ببساطة عن طريق وضع إبرة تشريح بين أنسجة الجسم من الدهون وoenocytes ، وقطع الاتصال عن طريق دفع الإبرة أسفل وعلى لوحة التشريح.
- جمع خيوط oenocyte بوكز ببساطة مع نهاية إبرة تشريح. مرة واحدة عالقة حتى نهاية الإبرة تشريح يمكن سحبها oenocytes ببطء عبر سطح متوسطة الثقافة. يمكن وضعها مباشرة في تشريح oenocytes العازلة تحلل الخلية المناسبة إما RNA أو استخراج البروتين. علما بأن oenocytes (شرائح البطن 2-5) من ذبابة واحدة من الذكور عادة غلات 15 20ng من الحمض النووي الريبي الإجمالي.
الرقم المجموعات :
الشكل 1. التعبير عن الجينات desaturase ، وdesat1 desatF في oenocytes الذكور والإناث د. melanogaster. عكس النسخ - PCR التضخيم من desat1 وdesatF من [كدنا] المستمدة من البالغين oenocytes الذكور والإناث. يتم التعبير عن الجينات desat1 في كل من الذكور والإناث oenocytes ؛ desatF ديمبرافيك التعبير الجنسي ، ويجري التعبير عنه في oenocytes حصرا للإناث. المقابلة لهذه الاختلافات في التعبير الجيني ، مطلوب desat1 لإنتاج المركبات الهيدروكربونية مشتركة في كل من الذكور والإناث 9 ، وتشارك desatF في إنتاج المركبات الهيدروكربونية الإناث 10،11 محددة. desatF وقد تبين أن أعرب على وجه التحديد في oenocytes الإناث في 12 التهجين الموقع. لاحظ أن يتم الحصول على متوسط 15 20ng من الحمض النووي الريبي من مجموع oenocytes تشريح من ذبابة الفردية. تم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام RNeasy الصغرى مجموعة (Qiagen) ؛ [كدنا] أنتجت باستخدام التوليف cDND qScript مجموعة (كوانتا العلوم البيولوجية)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة الفيديو نقدم بروتوكول تشريح مفصل لإعداد oenocytes من الكبار D. melanogaster بطريقة ملائمة للتحليل الجزيئي. وقد وصفت في النص القائم على حساب مختصر لطريقة تشريح أماكن أخرى 2 ، وثبت في إعداد الناشئة oenocyte لتكون مناسبة لاستخراج كل من الحمض النووي الريبي والبروتينات 2. باستخدام هذا الإعداد قد يكون من الممكن أيضا لتطوير أساليب للزراعة من oenocytes explanted. ومن شأن بروتوكول للثقافة يزدرع oenocyte المساعدات التحقيقات الرامية إلى تحديد القدرة الذاتية الأيضية لهذه الخلايا لتخليق وإفراز المكونات الكيميائية للمواد الهيدروكربونية جليدية. وهذه التقنيات في تركيبة مع خط oenocyte Gal4 - 4 وضعت مؤخرا ، والتي تسمح للتلاعب الجيني للاستهدفت oenocytes ، والسماح للتحليل مفصل الجينية الجزيئية وظيفة oenocyte في ذبابة الفاكهة الكبار.
تم العثور على خلايا Oenocyte سواء في يرقة الذبابة والكبار. في حين أن هذه الخلايا حصة العديد من أوجه التشابه المورفولوجية والتركيبية ، من المهم أن نلاحظ أن oenocytes على ذبابة الكبار تختلف عن تلك التي تنمويا التفريق أثناء التطور الجنيني وتوجد في مراحل اليرقات 5. وقد ذكرت وoenocytes الكبار أن تكون مشتقة من histoblasts 6 ، تشكل من جديد خلال pupation والاستمرار في زيادة العدد خلال الأسبوع الأول من حياة الكبار 7. في حين أن المطلوب من oenocytes من ذبابة الفاكهة البالغين لإنتاج الهيدروكربونات جليدية 4 ، فإنه لا يزال يتعين تحديد إذا oenocytes اليرقات دعم وظيفة مماثلة. وبالمثل ، oenocytes اليرقات الكبدية مثل الحفاظ على وظائف فيما يتعلق استقلاب الشحوم 8 ؛ دورا مماثلا لم يتم حتى الآن معروضة للoenocytes من الكبار. أظهرت استعدادا هنا ستساعد التحقيقات التي تهدف إلى تحديد الدرجة التي oenocytes اليرقات والبالغين تتشابه وظيفيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر Amsale بيلاي لمساعدتها في تصوير الفيديو من هذه المادة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل CIHR ، NSERC والمنح لجنة حقوق الطفل لرابطة الدفاع اليهودية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Dow Corning | ||
| Tungsten Wire | Ted Pella, Inc. | 27-11 | 0.005”/20’ |
| Forceps | Dumont | 11252-30 | #5 |
| Shields and Sang M3 Insect Medium | Sigma-Aldrich | S3652 | |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | |
| qScript cDNA Synthesis Kit | Quanta Biosciences | 95047-100 | |
| Monoject Hypodermic Needle | Harvard Apparatus | 722289 | 20G1 with aluminum hub |
References
- Wielowiejski, H. Ueber das blutgewebe der insekten. Zeit. Wiss. Zool. 43, 512-536 Forthcoming.
- Krupp, J. J., Kent, C., Billeter, J. C., Azanchi, R., So, A. K., Schonfeld, J. A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18, 1373-1383 (2008).
- Locke, M. Surface membranes, Golgi complexes, and vacuolar systems. Annu. Rev. Entomol. 48, 1-27 (2003).
- Billeter, J. C., Atallah, J., Krupp, J. J., Millar, J. G., Levine, J. D. Specialized cells tag sexual and species identity in Drosophila melanogaster. Nature. 461, 987-991 (2009).
- Gould, A. P., Elstob, P. R., Brodu, V. Insect oenocytes: a model system for studying cell-fate specification by Hox genes. J. Anat. 199, 25-33 (2001).
- Lawrence, P. A., Johnston, P. Cell lineage of the Drosophila abdomen: the epidermis, oenocytes and ventral muscles. J. Embryol. Exp. Morphol. 72, 197-208 (1982).
- Johnson, M. B., Butterworth, F. M. Maturation and aging of adult fat body and oenocytes in Drosophila as revealed by light microscopic morphometry. J. Morphol. 184, 51-59 (1985).
- Gutierrez, E., Wiggins, D., Fielding, B., Gould, A. P. Specialized hepatocyte-like cells regulate Drosophila lipid metabolism. Nature. 445, 275-280 (2007).
- Marcillac, F., Bousquet, F., Alabouvette, J., Savarit, F., Ferveur, J. F. A mutation with major effects on Drosophila melanogaster sex pheromones. Genetics. 171, 1617-1628 (2005).
- Chertemps, T., Duportets, L., Labeur, C., Ueyama, M., Wicker-Thomas, C. A female-specific desaturase gene responsible for diene hydrocarbon biosynthesis and courtship behaviour in Drosophila melanogaster. Insect Mol. Biol. 15, 465-473 (2006).
- Legendre, A., Miao, X. X., Da Lage, J. L., Wicker-Thomas, C. Evolution of a desaturase involved in female pheromonal cuticular hydrocarbon biosynthesis and courtship behavior in Drosophila. Insect. Biochem. Mol. Biol. 38, 244-255 (2008).
- Shirangi, T. R., Dufour, H. D., Williams, T. M., Carroll, S. B. Rapid evolution of sex pheromone-producing enzyme expression in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000168-e1000168 (2009).
