Summary
zebrafish 배아에서 alkyne - 태그 glycans의 급속한, 비침 투, 그리고 강력한 라벨을 허용 클릭 화학 기반 방법을 설명합니다. 후반 gastrulation 단계에 zebrafish 배아의 뒤덮었 레이어 Fucosylated glycans이 연구에서 몇 군데 있었다.
Abstract
생체내의 이미징 glycans 최근 azide 또는 alkyne - 태그 단당류 1, 2 세포 또는 유기체를 처리하여 bioorthogonal 화학 기자 전략을 사용하여 활성화되었습니다. glycan의 biosynthetic 기계에 의해 처리 수정 단당류는, 세포 표면 glycoconjugates에 통합됩니다. bioorthogonal azide 또는 alkyne 태그 다음 시각화를위한 형광 프로브와 공유 결합 결합을 허용하거나, 농축 및 glycoproteomic 분석을위한 화성 탐사선과. 의 뒤덮었 레이어 fucosylated glycans를 라벨 GDP - 5 - alkynylfucose (GDP - FucAl), 2 하나의 세포 단계의 배아 1) microinjection) :이 프로토콜을 포함하여 일반적으로 zebrafish 배아에서 fucosylated glycans의 비침 투 이미징에 사용되는 절차를 설명 공촛점 현미경 3 biocompatible 잘라내기 (I) 촉매 azide - alkyne cycloaddition의 (CuAAC), 3) 영상을 통해 azide - 복합 fluorophores와 zebrafish 배아. 여기에서 설명한 방법은 쉽게 glycans의 다른 클래스, sialic 산성 4 N - acetylgalactosamine 5, 6를 포함하는 예 glycans 개발 zebrafish과 다른 살아있는 생물에을 시각화하기 위해 확장될 수 있습니다.
Protocol
1. 에그 수집 및 Dechorionation
- 수집 및 35mm 페트리 접시에 zebrafish 달걀을 전송, 가능한 한 많은 물을으로 제거한 다음 E3 배아 매체 1 MG / ML Pronease 전자 (5 MM NaCl, 0.17 MM KCl, 0.33 MM CaCl 2 · 2 시간 2 O, 0.33 MM MgSO을 추가 chorion을 소화하기 위해 4, 산도 = 7.4).
- 3~5분 후, 생선 물 (리터 60 MG "인스턴트 오션 '소주 H 2 O)로 가득 비커에 요리를 병합하고, 부드럽게 비커에 달걀을 전송하고 계란 물을에"가을 "수 있습니다.
- 생선 물 세 번와 계란을 씻어. 대부분의 달걀들은 chorion에서 발표됩니다.
- 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 E3 배아 매체 가득 아가로 오스 - 코팅 배양 접시에 dechorionated 달걀을 전송합니다.
2. GDP - FucAl로 Microinjection
- 보고된 7 번 프로토콜 다음과 같은 사출 요리를 준비합니다.
- E3 배아 매체 가득 주입 요리에 dechorionated 계란을 전송합니다.
- 바늘을 준비, 2 μL 주입 솔루션을로드합니다. 이 솔루션은 추적기 0.2 M KCl에 페놀 레드 로딩 염료 (0.1 % W / V)와 같은 20 GDP - FucAl가 chemoenzymatically 8 합성 MM하거나, 알렉사 플루어 594 - dextran (5 % W / V)가 포함되어 있습니다. 대조군으로 주입 용액에 GDP - fucose와 GDP - FucAl를 교체하십시오.
- 바늘을 부수고 1 NL 드롭 9 얻을 수있는 분사 압력 및 시간을 조정합니다.
- 두 솔루션 1 NL와 계란을 주사.
- E3 배아 매체 가득 아가로 오스 - 코팅 배양 접시에 계란을 전송합니다.
- 28 ° C에서 알을 품어하고 배입니다 3-4시간 이내 unfertilized 계란을 제거합니다.
3. BTTES - 잘라내기 (I) 촉매 클릭 화학 반응
- 배아가 발달 단계 (예 : 후반 gastrula, 조직 세분화 및 초기 유충), 코트 아가로 오스와 96 - 웰 플레이트의 기반을 원하는 도달했을 때.
- 각 잘하는 92 μL E3 배아 매체를 추가, (H 2 O의 2.5 MM 주식에서) 4 μL 알렉사 플루어 - 488 azide를 추가하여 다음 2 μL BTTES - CuSO 4 6시 1분 복잡하고 섞어 부드럽게 발라줍니다.
- 잘 불타는 광택 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 클릭 화학 시약을 포함하는으로 배아를 전송합니다. 각 잘 다섯 배아 미만을 포함해야합니다.
- 클릭 반응 3 시작 2.5 μL 신선한 나트륨 아스코 브를 (H 2 O에서 100 MM 재고에서) 추가합니다. 각 시약의 최종 농도 : 알렉사 플루어 - 488 azide : 100 μm의, CuSO 4 : 50 μm의; BTTES : 300 μm의, 나트륨 아스코 브 : 2.5 MM.
- 3 분 후, 100 μL E3의 배아 매체 즉시 희석 후 반응을 담금질하기 위해, 2 μL bathocuproine sulphonate (H 2 O 50 MM 재고), biocompatible 구리 chelator를 추가합니다.
- 유리 페트리 접시에 배아를 전송 15 ML E3 배아 매체로 취급 태아에게 2 번 씻는다.
4. 이미징
- MatTek 유리 바닥 microwell 요리에 ultralow 용융 점 아가로 오스 (E3 배아 매체에서 1.2 % (W / V))의 방울 장소, 아가로 오스 드롭으로 배아를 놓으십시오.
- dorsally 또는 옆으로 배아를 위치와 아가로 오스 드롭을 응고 5 분 얼음 접시를 놓습니다. 그것은 아가로 오스 드롭을 커버 때까지 음식을 부드럽게 E3 배아 매체를 추가합니다.
- 형광 및 명시야 이미지는 순차적으로 공촛점 현미경을 사용하여 획득하고 있습니다. 모든 배아 이미지는 5 μm의 단계 간격을 사용하는 인수입니다. 복합 수치는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 준비가되어 있습니다.
5. 대표 결과
그림 1은 우리 두 단계 라벨링 전략의 흐름을 보여줍니다. 그림 2는 9.5 시간 게시물 수정 (HPF)에서 BTTES - 중재 CuAAC 통해 zebrafish 배아의 라벨을 보여줍니다. BTTES는 트리스 (triazolylmethyl) 아민 기반 리간드이다. 그것은 현장에서 생성된 잘라내기 (I)로 조정하면 극적으로 CuAAC 가속하고, 명백한 독성없이 생활 시스템에 빠르게 cycloaddition 반응을 촉진합니다. 즉시 3 분 클릭 반응 다음, 우리는 국내 총생산 (GDP) - FucAl 취급 배아의 강력한 라벨 (그림 2, 왼쪽 패널)을 감지할 수 있습니다. 단지 배경 형광은 GDP - fucose (그림 2, 오른쪽 패널)과 microinjected 제어 배아의 발견입니다.
그림 1. zebrafish 배아의 뒤덮었 레이어 fucosylated glycans를 라벨링의 전략.
그림 2. BTTES - 잘라내기 (I) 촉매를 클릭 화학 통해 zebrafish embryogenesis 동안 fucosylated glycans의 생체내 이미징에서. 한 세포 단계의 배아 zebrafish는 GDP - FucAl의 단일 복용과 함께 microinjected과 devel 수있게됩니다9.5 HPF로 조합. 배아는 다음 알렉사 플루어 BTTES - 잘라내기 (I)에 의해 488 - azide의 촉매와 반응하고 있습니다. 반응 배아는 공촛점 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 명시야 (하단 패널), 알렉사 플루어 488 형광 (어퍼 패널)의 최대 강도 Z - 프로젝션 이미지. 스케일 바 : 100 μm의.
문제 해결
| 문제 | 원인 | 치료제 |
| 배아는 건강에 해롭습보세요 | microinjected 솔루션은 오염 물질을 포함하고 | 뉴클레오 티드 설탕의 순도 85 %보다 커야한다. 소스를 확인합니다. |
| 반응 후 아무 라벨링이 없습니다 | 구리 농도는 아래 30 μm의 수 있습니다 | 배아를 추가할 때 구리 농도가 아래에 30 μm의 때 반응 속도가 크게 방울로 초과 E3의 배아 미디어를 추가하여 반응 용액을 희석하지 않도록주의하십시오. |
| 배아는 반응 후 다이 | 배아의 부적 절한 처리 | pipet 불타는 광택이며 반응 용기는 0.5 % 아가로 오스의 매우 얇은 레이어로 코팅되어 있는지 확인합니다. |
| 이미지가 낮아요보세요 | 시약은 제대로 배아를 추가하기 전에 혼합하지 않습니다 | 시약에 대한 이외의 권장 순서를 따라, 그리고 클릭 화학 시약 제대로 배아를 추가하기 전에 혼합되었는지 확인하십시오. |
| 이미지가 배아가 손상보기 | 반응 동안 힘차게 손해를 흔들림하면 배아 | 배아는 솔루션에 한번 부드럽게 미만 10 초 동안 흔들. |
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Discussion
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
의학의 알버트 아인슈타인 대학에서 시작 자금,이 작품은 부분적으로 국민 건강의 연구소 (RDS에 3U54AI057158 - 06S1 PW로 GM093282)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
| Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
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