Summary
Un click-chimica metodo basato che permette la rapida, etichettatura non invasivo, e robusto di alchini-tagged glicani in embrioni di zebrafish è descritto. Glicani Fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish in fase di gastrulazione fine erano ripreso in questo studio.
Abstract
Glicani di imaging in vivo è stato recentemente attivato utilizzando un bioorthogonal strategia giornalista chimica trattando cellule o degli organismi con monosaccaridi azide-o alchini-tag 1, 2. Il monosaccaridi modificato, elaborato dalla macchina biosintetica glicani, sono incorporati in glicoconiugati superficie cellulare. I tag bioorthogonal azide o alchini quindi consentire coniugazione covalente con sonde fluorescenti per la visualizzazione, oppure con sonde affinità per l'arricchimento e l'analisi glycoproteomic. Questo protocollo descrive le procedure normalmente utilizzate per l'imaging non invasivo di glicani fucosylated in embrioni di zebrafish, tra cui: 1) microiniezione di una cella-embrioni stadio con un PIL-5-alkynylfucose (PIL-FucAl), 2) l'etichettatura glicani fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish con azide coniugato fluorofori via Cu biocompatibile (I)-catalizzata azide-alchino cicloaddizione (CuAAC), e 3) l'imaging mediante microscopia confocale 3. Il metodo descritto qui può essere facilmente esteso ad altre classi di visualizzare glicani, glicani contenenti ad esempio acido sialico 4 e N-acetilgalattosamina 5, 6, in zebrafish di sviluppo e in altri organismi viventi.
Protocol
1. Uovo Raccolta e Dechorionation
- Raccogliere e trasferire le uova di pesce zebra piatto 35 millimetri di Petri, rimuovere l'acqua il più possibile e si aggiunge 1 mg / ml E Pronease nel medio embrione E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) per digerire il corion.
- Dopo 3-5 minuti, unire il piatto in un bicchiere pieno di pesci d'acqua (60 mg "Ocean istantanea" per litro distillata H 2 O), e delicatamente trasferire le uova nel becher e lasciare le uova di "caduta" in acqua.
- Lavare le uova con pesci d'acqua tre volte. La maggior parte delle uova saranno liberati dalla loro corion.
- Utilizzando un incendio lucidato vetro pipetta Pasteur, trasferire le uova dechorionated di agarosio rivestite piastre di Petri riempite con terreno di embrione E3.
2. Microiniezione con un PIL-FucAl
- Preparare i piatti dopo l'iniezione del protocollo riportato 7.
- Trasferimento uova dechorionated in piatti pieni di iniezione medio embrione E3.
- Preparare l'ago, e caricare con 2 microlitri soluzione iniettabile. Questa soluzione contiene 20 mM PIL FucAl sintetizzato chemoenzymatically 8 e sia Alexa Fluor 594-destrano (5% w / v) come tracciante o rosso fenolo carico colorante (0,1% w / v) in 0,2 M KCl. Come controllo negativo, sostituire il PIL con un PIL-FucAl-fucosio in soluzione iniettabile.
- Rompere l'ago e regolare la pressione di iniezione e la durata per produrre un 1 goccia nL 9.
- Iniettare le uova con 1 nL di entrambe le soluzioni.
- Trasferire le uova in agarosio rivestite piastre di Petri riempite con terreno di embrione E3.
- Incubare le uova a 28 ° C ed eliminare le uova non fecondate entro tre o quattro ore dopo la fecondazione.
3. BTTES-Cu (I)-catalizzata reazione chimica Clicca
- Quando gli embrioni raggiungono desiderato stadi di sviluppo (ad esempio gastrula tardiva, la segmentazione dei tessuti e larve presto), cappotto alla base di una piastra da 96 pozzetti con agarosio.
- Aggiungere 92 microlitri di media embrione E3 in ogni pozzetto, seguita da aggiunta di 4 microlitri Alexa Fluor-488 azide (da uno stock 2,5 mm H 2 O), 2 microlitri BTTES-CuSO 4 6:01 complesso, e agitare delicatamente per miscelare.
- Trasferimento degli embrioni nel pozzo contenente il reagente chimico clic utilizzando un incendio lucidato vetro pipetta Pasteur. Ogni bene deve contenere meno di cinque embrioni.
- Aggiungere 2,5 microlitri ascorbato di sodio preparata (da uno stock di 100 mm H 2 O) per iniziare l'attacco su 3. Concentrazione finale di ogni reagente: Alexa Fluor-488 azide: 100 mM; CuSO 4: 50 micron; BTTES: 300 mM; ascorbato di sodio: 2,5 mm.
- Dopo 3 minuti, aggiungere 2 microlitri bathocuproine solfonato (50 mM magazzino in H 2 O), un chelante del rame biocompatibile, per placare la reazione poi diluire subito con 100 microlitri di media embrione E3.
- Trasferire gli embrioni per un piatto di vetro di Petri e lavare gli embrioni trattati 2 volte con 15 ml di media embrione E3.
4. Imaging
- Mettere una goccia di bassissimo punto di fusione agarosio (1,2% (w / v) in un mezzo embrione E3) su un fondo di vetro piatto MatTek pozzetti, e posto un embrione nella goccia di agarosio.
- Posizionare gli embrioni dorsalmente o lateralmente e posizionare il piatto in ghiaccio per 5 minuti a solidificare la goccia di agarosio. Aggiungi medio E3 embrione dolcemente verso il piatto fino a coprire il calo di agarosio.
- Immagini di campo fluorescenza e luminose vengono acquisiti in sequenza usando un microscopio confocale. Tutte le immagini degli embrioni vengono acquisite utilizzando un intervallo di fase 5 micron. Figure compositi sono stati preparati utilizzando il software ImageJ.
5. Rappresentante Risultati
La figura 1 mostra il flusso di lavoro della nostra strategia in due fasi di etichettatura. La Figura 2 mostra l'etichettatura di embrioni di zebrafish via BTTES-mediata CuAAC al 9,5 ore dopo la fecondazione (HPF). BTTES è un (triazolylmethyl) ammina tris a base di legante. Accelera CuAAC drammaticamente quando coordinamento con il Cu generato in situ (I), e promuove la reazione di cicloaddizione rapidamente nei sistemi viventi senza tossicità apparente. Subito dopo un 3-minuti di reazione su, siamo in grado di rilevare l'etichettatura robusta degli embrioni trattati PIL FucAl (Figura 2, pannelli a sinistra). Fluorescenza di fondo è rilevato solo per gli embrioni di controllo microiniettati con il PIL-fucosio (Figura 2, pannelli a destra).
Figura 1. La strategia di etichettatura glicani fucosylated nello strato avvolgente di embrioni di zebrafish.
Figura 2. In imaging in vivo di glicani fucosylated durante l'embriogenesi zebrafish via BTTES-Cu (I)-chimica catalizzata clic. Unicellulare embrioni di zebrafish fase sono microiniettati con una singola dose del PIL-FucAl e ha permesso di sviluppoop a 9,5 HPF. Gli embrioni vengono poi reagito con Alexa Fluor 488-azide catalizzata da BTTES-Cu (I). Gli embrioni vengono esposte reagito usando la microscopia confocale. Intensità massima di z-proiezione immagini di Alexa Fluor 488 fluorescenza (pannello superiore); campo Bright (pannello inferiore). Scala grafica: 100 micron.
Risoluzione dei problemi
| Problema | Causa | Rimedio |
| Gli embrioni aspetto malsano | La soluzione microiniettati contiene contaminanti | La purezza degli zuccheri nucleotide deve essere superiore all'85%. Controlla la tua fonte. |
| Non c'è sull'etichetta dopo la reazione | Concentrazione di rame è inferiore a 30 micron | Fare attenzione a non diluire la soluzione di reazione con l'aggiunta di eccesso di media embrione E3 quando si aggiungono gli embrioni, come la velocità di reazione diminuisce in maniera significativa quando la concentrazione di rame è inferiore a 30 micron. |
| Gli embrioni muoiono dopo la reazione | Uso improprio degli embrioni | Assicurarsi che la pipetta è fuoco lucidato e il recipiente di reazione è rivestita con uno strato molto sottile di 0,5% di agarosio. |
| Le immagini appaiono spotty | I reagenti non sono propriamente mescolati prima di aggiungere gli embrioni | Seguire l'ordine consigliato di aggiunta dei reagenti, e assicurarsi che i reagenti clicca chimica sono stati opportunamente miscelati prima di aggiungere gli embrioni. |
| Le immagini mostrano gli embrioni vengono danneggiati | Vigorosa agitazione danni degli embrioni durante la reazione | Agitare delicatamente per meno di 10 secondi una volta gli embrioni sono nella soluzione. |
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Discussion
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato in parte sostenuto dal National Institutes of Health (GM093282 di PW; 3U54AI057158-06S1 a RDS) e fondi di avvio di Albert Einstein College of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
| Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
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