Summary
השיטה מבוססת על כימיה המאפשר תיוג, מהיר פולשנית, ויציב של alkyne-tagged glycans עוברי דג הזברה מתואר. Glycans Fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה בשלב מאוחר gastrulation היו הדמיה במחקר זה.
Abstract
Glycans Imaging in vivo לאחרונה מופעל באמצעות אסטרטגיה bioorthogonal הכתב על ידי טיפול כימי בתאים או אורגניזמים עם מונוסכרידים אזיד או alkyne-tagged 1, 2. מונוסכרידים שונה, מעובד על ידי המנגנון biosynthetic glycan, ישולבו glycoconjugates פני התא. תגיות bioorthogonal אזיד או alkyne מכן לאפשר נטיה קוולנטיים עם בדיקות ניאון להדמיה, או עם בדיקות זיקה העשרה ניתוח glycoproteomic. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים משמש בדרך כלל עבור הדמיה לא פולשנית של glycans fucosylated עוברי דג הזברה, כולל: 1) microinjection של אחד התאים עוברים שלב עם תמ"ג-5-alkynylfucose (תמ"ג-FucAl), 2) תיוג glycans fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה עם אזיד-מצומדות fluorophores דרך Cu ביולוגית (אני)-catalyzed אזיד-alkyne cycloaddition (CuAAC), ו 3) הדמיה באמצעות מיקרוסקופיה confocal 3. השיטה המתוארת כאן ניתן להרחיב בקלות לדמיין בסוגים אחרים של glycans, glycans למשל המכילים חומצה sialic 4 ו N-acetylgalactosamine 5, 6, דג הזברה מתפתח בתוך אורגניזמים חיים אחרים.
Protocol
1. ביצה איסוף Dechorionation
- איסוף והעברת ביצי דג הזברה על צלחת פטרי 35mm, להסיר כמו מים רב ככל האפשר ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ג / מ"ל E Pronease במדיום העובר E3 (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0.33 mM MgSO 4, pH = 7.4) לעכל את סיסית.
- אחרי 3-5 דקות, למזג את המנה לתוך כוס מלא מים ודגים (60 מ"ג "אושן מיידית" לליטר מזוקקים H 2 O), בעדינות להעביר את הביצים כוס ולאפשר ביצים כדי "ליפול" לתוך המים.
- יש לשטוף את הביצים במים דגים שלוש פעמים. רוב הביצים ישוחרר מן סיסית שלהם.
- באמצעות אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר, להעביר את הביצים dechorionated כדי agarose מצופה בצלחות פטרי מלאות בינוני העובר E3.
2. Microinjection עם תוצר FucAl
- הכן את הכלים הבאים הזרקה פרוטוקול דיווח 7.
- העברת ביצים dechorionated לתוך הזרקת מנות מלאות בינוני העובר E3.
- הכן את המחט, עומס פתרון 2 הזרקה μL. פתרון זה מכיל 20 מ"מ תוצר FucAl מסונתז chemoenzymatically 8 ו או פלואוריד אלקסה 594-dextran (5% w / v) כמו נותב או פנול טעינה צבע אדום (0.1% w / v) ב 0.2 M KCl. כביקורת שלילית, ולהחליף תוצר FucAl עם תוצר fucose בפתרון ההזרקה.
- לשבור את המחט ולהתאים את הלחץ הזרקת ומשך להניב ירידה 1 NL 9.
- הזרק את הביצים עם 1 NL של פתרון או.
- מעבירים את הביצים לתוך agarose מצופה בצלחות פטרי מלאות בינוני העובר E3.
- לדגור על ביצים 28 ° C ו להסיר את הביצים מופרית בתוך שלוש עד ארבע שעות לאחר ההפריה.
3. BTTES-Cu (אני)-catalyzed התגובה לכימיה לחץ
- כאשר עוברים את הטווח הרצוי שלבי ההתפתחות (gastrula מאוחר למשל, פילוח רקמות זחל מוקדם), מעיל בסיס צלחת 96-agarose היטב.
- הוסף 92 העובר μL בינוני E3 היטב לכל, ואחריו תוספת של 4 μL אזיד Alexa-488 פלואוריד (ממלאי 2.5 מ"מ H 2 O), 2 μL BTTES-CuSO 4 06:01 מורכבת, ללחוץ בעדינות לתערובת.
- העברת עוברים לבאר המכיל את הכימיה לחץ מגיב באמצעות אש זכוכית מלוטשת פיפטה פסטר. כל טוב צריך להכיל פחות מחמישה עוברים.
- הוסף 2.5 נתרן μL ascorbate מוכן טרי (ממלאי 100 מ"מ H 2 O) ליזום את תגובת לחץ על 3. הריכוז הסופי של כל אחד מגיב: Alexa פלואוריד-488 אזיד: 100 מיקרומטר; CuSO 4: 50 מיקרומטר; BTTES: 300 מיקרומטר; ascorbate נתרן: 2.5 מ"מ.
- לאחר 3 דקות, להוסיף 2 bathocuproine sulphonate μL (50 מניות מ"מ H 2 O), chelator נחושת ביולוגית, כדי להרוות את התגובה ואז לדלל מיד עם 100 בינוני E3 μL העובר.
- מעבירים את העוברים על צלחת זכוכית פטרי ולשטוף את העוברים שטופלו 2 פעמים עם 15 בינוני העובר E3 מ"ל.
4. הדמיה
- מניחים ירידה של נקודת התכה ultralow agarose (1.2% (w / v) במדיום העובר E3) על צלחת תחתית זכוכית MatTek microwell, והמקום עובר לתוך הירידה agarose.
- מקם את העוברים dorsally או רוחבית המקום צלחת על הקרח במשך 5 דקות כדי לחזק את הירידה agarose. הוסף בינוני העובר E3 בעדינות כדי בצלחת עד שהוא מכסה את הירידה agarose.
- תמונות שדה הקרינה ובהיר נרכשים ברצף באמצעות מיקרוסקופ confocal. כל התמונות העובר נרכשים באמצעות מרווח צעד 5 מיקרומטר. דמויות Composite מוכנים באמצעות תוכנת ImageJ.
5. נציג תוצאות
איור 1 מציג את זרימת העבודה של האסטרטגיה שלנו שני שלבים תיוג. איור 2 מציג את התיוג של עוברי דג הזברה דרך CuAAC BTTES בתיווך על הפריה 9.5 שעות שלאחר (hpf). BTTES הוא (triazolylmethyl) טריס אמין מבוססי ליגנד. היא מאיצה באופן דרמטי כאשר CuAAC בתיאום עם ב Cu שנוצר באתרו (אני), ומקדם את התגובה cycloaddition במהירות במערכות החיים ללא לרעילות נראית לעין. מיד לאחר התגובה של 3 דק 'לחץ, אנו מסוגלים לזהות תיוג חזקים מהתמ"ג-FucAl עוברים טיפול (איור 2, לוחות משמאל). הקרינה רקע רק מזוהה עבור עוברים בקרת microinjected עם תוצר fucose (איור 2, לוחות מימין).
באיור 1. האסטרטגיה של תיוג glycans fucosylated בשכבה העוטפת של עוברי דג הזברה.
איור 2. הדמיה vivo של glycans fucosylated במהלך embryogenesis דג הזברה דרך BTTES-Cu (אני)-catalyzed כימיה לחץ. אחת תא עוברי דג הזברה הבמה microinjected עם מינון בודד של תוצר FucAl ו מותר develאל אופ hpf 9.5. עוברים הם הגיבו אז עם אלקסה פלואוריד 488-אזיד catalyzed ידי BTTES-Cu (I). עוברים הגיבו הם צילמו באמצעות מיקרוסקופ confocal. מקסימום Z-הקרנת העוצמה תמונות של אלקסה פלואוריד פלואורסצנציה 488 (הפאנל העליון); שדה מוארת (הפאנל התחתון). בר קנה מידה: 100 מיקרומטר.
פתרון בעיות
| בעיה | לגרום | תרופה |
| עוברים נראים בריאים | הפתרון microinjected מכיל מזהמים | טוהר של סוכרים נוקלאוטיד צריך להיות גדול מ 85%. בדוק את המקור שלך. |
| אין תיוג לאחר התגובה | ריכוז נחושת היא מתחת ל -30 מיקרומטר | היזהר שלא לדלל את הפתרון על ידי הוספת תגובה בינוני עודף העובר E3 בעת הוספת העוברים, כמו קצב התגובה יורד באופן משמעותי כאשר ריכוז הנחושת הוא מתחת ל -30 מיקרומטר. |
| עוברים מתים לאחר התגובה | טיפול לא נכון של העוברים | ודא pipet היא אש מלוטשים כלי התגובה מצופה בשכבה דקה מאוד של agarose 0.5%. |
| הדימויים נראים פצעונים | ריאגנטים לא מעורבבים היטב לפני הוספת עוברים | פעל על פי צו המומלצת של תוספת עבור ריאגנטים, ולוודא כי הכימיה ריאגנטים לחץ להיות מעורב כראוי לפני הוספת עוברים. |
| התמונות מראות את העוברים ניזוקים | נמרץ רועד פוגע בעוברים במהלך התגובה | נערו בעדינות פחות מ 10 שניות פעם עוברים הם הפתרון. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (GM093282 אל PW; 3U54AI057158-06S1 כדי RDS) וקרנות ההפעלה של אלברט איינשטיין לרפואה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
| Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R.
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D. Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans. J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).
- Chang, P. V. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. , (2009).
- Wang, W. Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. , (2009).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
