Summary
Клик-химии основан метод, который позволяет оперативно, неинвазивным и надежный маркировки алкин с метками гликанов в данио эмбрионов описано. Фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов в поздней стадии гаструляции были обследованы в этом исследовании.
Abstract
Изображений гликанов в естественных условиях была недавно включена с использованием bioorthogonal стратегии репортер химической обработкой клеток или организмов с азид или алкин с метками моносахаридов 1, 2. Изменение моносахаридов, обрабатывается механизм биосинтеза гликана, включаются в гликоконъюгатов поверхности клетки. Bioorthogonal теги или азид алкин затем позволить ковалентные сопряжения с флуоресцентных зондов для визуализации, или с близостью зонды для обогащения и glycoproteomic анализа. Этот протокол описывает процедуры, как правило, используется для неинвазивной визуализации фукозилированных гликанов в данио эмбрионов, в том числе: 1) микроинъекции одноклеточного эмбриона сцене с ВВП-5-alkynylfucose (ВВП-FucAl), 2) маркировка фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов с азид-сопряженных флуорофоров с помощью биосовместимых Cu (I)-катализируемой азид-алкин циклоприсоединения (CuAAC), и 3) изображений с помощью конфокальной микроскопии 3. Метод, описанный здесь, может быть легко распространено на себе другие классы гликанов, например гликанов содержащие сиаловой кислоты 4 и N-ацетилгалактозамина 5, 6, в развивающихся данио и других живых организмов.
Protocol
1. Сбор яиц и Dechorionation
- Сбор и передача данио яиц блюдо Петри 35 мм, удалить столько воды, сколько возможно, а затем добавьте 1 мг / мл Pronease Е в E3 среда эмбриона (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 мМ MgSO 4, рН = 7,4), чтобы переварить хориона.
- Через 3-5 минут, слияние блюдо в стакан заполненный рыбой воды (60 мг "мгновенный океан" на литр дистиллированной H 2 O), и мягко передачи яйца в стакан и дайте яйца "падение" в воду.
- Промыть рыбу яйца с водой в три раза. Большинство яиц, будут освобождены от своих хориона.
- Использование пожарной полированное стекло пипетки Пастера перенести dechorionated яйца агарозном покрытием чашки Петри заполнены E3 среда эмбриона.
2. Микроинъекция с ВВП FucAl
- Подготовка инъекций блюда, следующего за отчетным протокола 7.
- Передача dechorionated яйца в инъекции блюда заполнены E3 среда эмбриона.
- Подготовка иглу, и загрузить с 2 мкл инъекционного раствора. Это решение содержит 20 мМ ВВП FucAl синтезированных chemoenzymatically 8 и либо Alexa Fluor 594-декстрана (5% в / о) в качестве индикатора или фенола красного красителя загрузки (0,1% м / о) в 0,2 М KCl. В качестве отрицательного контроля, заменить ВВП с ВВП FucAl-фукозы в раствор для инъекций.
- Перерыв иглу и отрегулировать давление впрыска и длительности для получения 1 NL падения 9.
- Inject яйца с 1 NL либо решение.
- Передача яйца в агарозном покрытием чашках Петри заполнены E3 среда эмбриона.
- Инкубировать яйца при 28 ° C и удалить неоплодотворенные яйца в течение трех-четырех часов после оплодотворения.
3. BTTES-Cu (I)-катализируемой реакции химии нажмите
- Когда эмбрионы достигают желаемого стадиях развития (например, поздней гаструлы, ткани сегментации и в начале личинка), флаг базе 96-луночного планшета с агарозы.
- Добавить 92 мкл E3 среда эмбриона в каждую лунку с последующим добавлением 4 мкл Alexa Fluor-488 азид (от 2,5 ммоль складе в H 2 O), 2 мкл BTTES-CuSO 4 6:01 комплекса, и встряхните осторожно перемешать.
- Трансфер эмбрионов в колодец содержащих реагент нажмите химии использованием пожарной полированное стекло пипетки Пастера. Каждая скважина должна содержать менее чем за пять эмбрионов.
- Добавить 2,5 мкл свежеприготовленного аскорбат натрия (от 100 мМ складе в H 2 O), чтобы инициировать реакцию нажмите 3. Конечная концентрация каждого реагента: Alexa Fluor-488 азид: 100 мкМ CuSO 4: 50 мкМ; BTTES: 300 мкМ; аскорбат натрия: 2,5 мм.
- Через 3 минуты, добавить 2 мкл bathocuproine сульфонат (50 мМ акций H 2 O), биосовместимые хелат меди, чтобы утолить реакции затем разбавить сразу с 100 мкл среды эмбрион Е3.
- Трансфер эмбрионов на стеклянном блюде Петри и мыть обработанные эмбрионов 2 раза с 15 мл E3 среда эмбриона.
4. Изображений
- Место падения сверхнизкой температуры плавления агарозы (1,2% (м / о) в Е3 среда эмбриона) на нижней Маттек стеклянной посуде микролуночные, и поместить эмбрион в каплю агарозы.
- Позиция эмбрионов сверху или сбоку и поместить блюдо на льду в течение 5 мин, чтобы укрепить падение агарозы. Добавить Е3 среда эмбриона осторожно, чтобы блюдо, пока он охватывает падение агарозы.
- Флуоресценции и яркие изображения области приобрел последовательно использованием конфокальной микроскопии. Все изображения эмбрионов, приобретенный с помощью 5 мкм шагом интервала. Композитный цифры подготовлен с использованием программного обеспечения ImageJ.
5. Представитель Результаты
На рисунке 1 показан рабочий процесс нашего двухступенчатый маркировки стратегии. На рисунке 2 показана маркировка эмбрионов данио рерио через BTTES-опосредованной CuAAC на 9,5 часа после оплодотворения (HPF). BTTES является трис (triazolylmethyl) амин основе лиганда. Это ускоряет CuAAC резко при согласовании с на месте порожденных Cu (I), а также способствует реакции циклоприсоединения быстро в живых системах без видимой токсичности. Сразу же после 3-мин нажмите реакции, мы можем обнаружить надежные маркировки ВВП FucAl лечение эмбрионов (рис. 2, слева панели). Только флуоресценции фона определяется для контроля эмбрионов microinjected с ВВП-фукозы (рис. 2, правой панели).
Рисунок 1. Стратегии маркировки фукозилированных гликанов в обертывающей слой данио эмбрионов.
Рисунок 2. В естественных изображений фукозилированных гликанов во время эмбриогенеза данио через BTTES-Cu (I)-катализируемой химии мыши. Один-клеток эмбрионов данио этапе являются microinjected с разовой дозы ВВП FucAl и позволили развисоч до 9,5 HPF. Эмбрионов затем реагирует с Alexa Fluor 488-азид, катализируемой BTTES-Cu (I). Отреагировали эмбрионов изображаются с помощью конфокальной микроскопии. Максимальная интенсивность г-проектирования изображения Alexa Fluor 488 флуоресценции (верхние панели); Яркий поле (нижний график). Шкала бар: 100 мкм.
Поиск неисправностей
| Проблема | Вызывать | Средство |
| Эмбрионы выглядят нездоровыми | Microinjected решение содержит загрязнений | Чистота нуклеотидных сахара должно быть больше 85%. Проверьте ваш источник. |
| Существует никакой маркировки после реакции | Концентрация меди ниже 30 мкМ | Будьте осторожны, чтобы не разбавлять реакционного раствора, добавляя избыток среда эмбриона E3 при добавлении эмбрионов, так как скорость реакции существенно снижается, когда концентрация меди ниже 30 мкМ. |
| Эмбрионы погибают после реакции | Неправильное обращение с эмбрионами | Убедитесь в том, пипетки является огневой полировкой и реакционного сосуда покрыта очень тонким слоем 0,5% агарозы. |
| Изображения выглядят пятнистым | Реагенты не должным образом смешиваются перед добавлением эмбрионов | Следуйте Рекомендуемый порядок дополнение для реагентов, и убедитесь, что реагенты нажмите химии были должным образом смешиваются перед добавлением эмбрионов. |
| Изображения показывают эмбрионов повреждены | Энергичного встряхивания ущерб эмбрионов в ходе реакции | Осторожно встряхните менее 10 секунд после эмбрионы в раствор. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здоровья (GM093282 для PW; 3U54AI057158-06S1 с RDS) и ввод в эксплуатацию средств из колледжа Альберта Эйнштейна медицины.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
| Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R.
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D. Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans. J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).
- Chang, P. V. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. , (2009).
- Wang, W. Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. , (2009).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
