Summary
Een klik-chemie gebaseerde methode die het mogelijk maakt voor de snelle, niet-invasieve, en robuuste etikettering van alkyn-tagged glycanen in zebravis embryo's wordt beschreven. Gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van de zebravis embryo's in de late gastrulatie stadium waren afgebeeld in deze studie.
Abstract
Imaging glycanen in vivo is onlangs ingeschakeld met een bioorthogonal chemische verslaggever strategie door het behandelen van cellen of organismen met een azide-of alkyn-tagged monosachariden 1, 2. De gewijzigde monosacchariden, verwerkt door de glycan biosynthetische machines, worden opgenomen in het celoppervlak glycoconjugaten. De bioorthogonal azide of alkyn labels laat vervolgens covalente conjugatie met fluorescerende probes voor visualisatie, of met affiniteit probes voor verrijking en glycoproteomic analyse. Dit protocol beschrijft de procedures doorgaans gebruikt voor niet-invasieve beeldvorming van de gefucosyleerde glycanen in zebravis embryo's, waaronder: 1) micro-injectie van een-cellig stadium embryo's met een BBP-5-alkynylfucose (BBP-FucAl), 2) de etikettering gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van zebravis embryo's met azide-geconjugeerde fluoroforen via biocompatibel Cu (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC), en 3) beeldvorming door confocale microscopie 3. De hier beschreven methode kan gemakkelijk worden uitgebreid tot andere klassen van glycanen, bv. glycanen bevat sialinezuur 4 en N-acetylgalactosamine 5, 6, bij de ontwikkeling van de zebravis en in andere levende organismen te visualiseren.
Protocol
1. Ei Verzamelen en Dechorionation
- Verzamelen en zebravis eieren tot 35mm petrischaal overdracht, verwijder zoveel mogelijk water en voeg dan 1 mg / ml Pronease E in E3 embryo medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) aan de chorion verteren.
- Na 3-5 minuten, het samenvoegen van de schotel in een bekerglas gevuld met vis water (60 mg "instant Ocean" per liter gedestilleerd H 2 O), en voorzichtig de eieren over te dragen aan de beker en laat de eieren 'vallen' in het water.
- Spoel de eieren met vis water drie keer. De meeste eieren worden vrijgelaten uit hun chorion.
- Met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur pipet de dechorionated eieren agarose-gecoate petrischalen gevuld met E3 embryo medium.
2. Micro-injectie met een BBP-FucAl
- Bereid de injectie gerechten volgend op de verslagperiode protocol 7.
- Overdracht dechorionated eieren in gerechten injectie gevuld met E3 embryo medium.
- De voorbereiding van de naald, en de belasting met 2 pl oplossing voor injectie. Deze oplossing bevat 20 mM GDP-FucAl chemoenzymatically 8 gesynthetiseerd en ofwel Alexa Fluor 594-dextraan (5% w / v) als een tracer of fenol rood laden kleurstof (0,1% w / v) in 0,2 M KCl. Als een negatieve controle, vervang het BBP-FucAl het BBP-fucose in oplossing voor injectie.
- De naald breken en stel de injectiedruk en duur om een 1 nL druppel 9 opleveren.
- Injecteer de eieren met een nL van een van beide oplossing.
- Breng de eieren in agarose-coated petrischalen gevuld met E3 embryo medium.
- Incubeer de eieren bij 28 ° C en verwijder de onbevruchte eitjes binnen drie tot vier uur na de bevruchting.
3. BTTES-Cu (I)-gekatalyseerde Klik Chemie Reaction
- Als de embryo's te bereiken gewenste ontwikkelingsstadia (bijv. laat gastrula, weefsel segmentatie en vroege larve), coat de basis van een 96-wells plaat met agarose.
- Voeg 92 uL E3 embryo medium aan elk putje, gevolgd door toevoeging van 4 pi Alexa Fluor-488 azide (van een 2,5 mM voorraad in H 2 O), 2 pi BTTES-CuSO 4 06:01 complex, en schud voorzichtig om te mengen.
- Transfer embryo's in de put met de klik chemie reagens met behulp van een brand-gepolijst glas Pasteur pipet. Elk goed moeten bevatten minder dan vijf embryo's.
- Voeg 2,5 ul vers bereide natriumascorbaat (uit een 100 mM voorraad in H 2 O) om de klik reactie 3 te starten. Uiteindelijke concentratie van elk reagens: Alexa Fluor-488 azide: 100 uM, CuSO 4: 50 pM; BTTES: 300 micrometer, natriumascorbaat: 2,5 mM.
- Na 3 minuten, voeg 2 pl bathocuproine sulfonaat (50 mM voorraad in H 2 O), een biocompatibel koper chelator, om de reactie te blussen dan direct verdunnen met 100 ul E3 embryo medium.
- Overdracht van de embryo's op een glazen petrischaal en was het behandelde embryo's twee keer met 15 ml E3 embryo medium.
4. Imaging
- Plaats een druppel van Ultra-smeltpunt agarose (1,2% (w / v) in E3 embryo medium) op een MatTek met glazen bodem microwell schaal en leg een embryo in de agarose laten vallen.
- Plaats de embryo's dorsaal of lateraal en plaats de schotel op ijs gedurende 5 minuten naar het agarose laten vallen stollen. Voorzichtig toe te voegen E3 embryo medium om de schotel tot hij dekt de agarose te laten vallen.
- Fluorescentie en helderveld beelden werden achter elkaar met behulp van een confocale microscoop. Alle embryo beelden worden verkregen met behulp van een 5 um stap interval. Composiet cijfers zijn opgesteld volgens ImageJ software.
5. Representatieve resultaten
Figuur 1 toont de workflow van onze twee-staps labeling strategie. Figuur 2 toont de etikettering van de zebravis embryo's via BTTES-gemedieerde CuAAC van 9,5 uur na de bevruchting (HPF). BTTES is een tris (triazolylmethyl) amine gebaseerde ligand. Het versnelt CuAAC dramatisch bij de coördinatie van de in situ gegenereerde Cu (I), en bevordert de cycloadditiereactie snel in levende systemen zonder duidelijke toxiciteit. Onmiddellijk na een 3-min op reactie, we zijn in staat om robuuste etikettering van het BBP-FucAl behandelde embryo's (figuur 2, links panelen) te detecteren. Alleen achtergrond fluorescentie wordt gedetecteerd voor controle embryo's gemicroinjecteerd het BBP-fucose (figuur 2, rechts panelen).
Figuur 1. De strategie van de etikettering gefucosyleerde glycanen in de omhullende laag van zebravis embryo's.
Figuur 2. In vivo beeldvorming van gefucosyleerde glycanen tijdens de zebravis embryogenese via BTTES-Cu (I)-gekatalyseerde klik chemie. One-cellig stadium zebravis embryo's zijn gemicroinjecteerd met een enkele dosis van het BBP-FucAl en mag ontop tot 9,5 hpf. De embryo's worden vervolgens reageren met Alexa Fluor 488-azide gekatalyseerd door BTTES-Cu (I). Reageerde embryo's worden afgebeeld met behulp van confocale microscopie. Maximumsterkte z-projectie beelden van Alexa Fluor 488 fluorescentie (bovenste paneel), Bright veld (onderste paneel). Schaal bar: 100 urn.
Het oplossen van problemen
| Probleem | Veroorzaken | Remedie |
| De embryo's kijken ongezond | De gemicroinjecteerd oplossing bevat verontreinigingen | De zuiverheid van de nucleotide suikers moet groter zijn dan 85%. Controleer uw bron. |
| Er is geen etiket na de reactie | Koper concentratie onder de 30 uM | Wees voorzichtig dat u de reactie-oplossing te verdunnen door het toevoegen van overtollige embryo's E3 medium bij het toevoegen van de embryo's, zoals de reactiesnelheid daalt aanzienlijk wanneer de koper concentratie onder de 30 uM. |
| De embryo's sterven na de reactie | Onjuiste behandeling van de embryo's | Zorg ervoor dat de pipet is vuur-gepolijst en het reactievat is bekleed met een zeer dunne laag van 0,5% agarose. |
| De beelden zien spotty | De reagentia zijn niet goed gemengd voor het toevoegen van de embryo's | Volg de aanbevolen volgorde van toevoeging van de reagentia, en zorg ervoor dat de klik chemie reagentia goed zijn gemengd voor het toevoegen van de embryo's. |
| De beelden tonen de embryo's zijn beschadigd | Krachtig schudden schade de embryo's tijdens de reactie | Schud voor minder dan 10 seconden nadat de embryo's worden in de oplossing. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health (GM093282 naar PW; 3U54AI057158-06S1 tot RDS) en het opstarten van fondsen van Albert Einstein College of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
| Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R.
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D. Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans. J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).
- Chang, P. V. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. , (2009).
- Wang, W. Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. , (2009).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
