Summary
Um método baseado em clique química que permite a rotulagem, rápida não invasiva, e robusta de alcino com tags glicanos em embriões de peixe-zebra é descrito. Glicanos Fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish na fase final de gastrulação foram fotografadas neste estudo.
Abstract
Glicanos de imagem in vivo foi recentemente ativado usando uma estratégia repórter bioorthogonal química por tratar células ou organismos com azida ou alcino marcadas monossacarídeos 1, 2. Os monossacarídeos modificado, processados pela máquina biossintética glicano, são incorporados glicoconjugados de superfície celular. As tags bioorthogonal azida ou alcino então permitir a conjugação covalente com sondas fluorescentes para a visualização, ou afinidade com sondas para o enriquecimento e análise glycoproteomic. Este protocolo descreve os procedimentos normalmente utilizados para imagem não invasivos de glicanos fucosylated em embriões de peixe-zebra, incluindo: 1) microinjeção de um celular em embriões em estágio com o PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) rotulagem glicanos fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish com azida conjugada fluoróforos via Cu biocompatível (I)-catalisada cicloadição azida-alcino (CuAAC), e 3) de imagens por microscopia confocal 3. O método descrito aqui pode ser facilmente estendido para visualizar as outras classes de glicanos, glicanos por exemplo, contendo ácido siálico 4 e N-acetilgalactosamina 5, 6, em zebrafish em desenvolvimento e em outros organismos vivos.
Protocol
1. Coleta de ovos e Dechorionation
- Coletar e transferir os ovos zebrafish a 35mm placa de Petri, remova tanta água quanto possível e então adicione 1 E Pronease mg / ml em meio embrião E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) para digerir o córion.
- Depois de 3-5 minutos, fundir o prato em um copo cheio de água de peixe (60 mg "Ocean instantânea" por litro destilada H 2 O), e gentilmente transferir os ovos para o copo e deixe os ovos para "cair" na água.
- Lave os ovos com peixes de água três vezes. A maioria dos ovos serão liberados de suas córion.
- Usando um fogo-de vidro polido Pasteur pipeta, transferir os ovos para dechorionated pratos agarose revestidas de petri preenchida com meio embrião E3.
2. Microinjeção com o PIB-FucAl
- Prepare os pratos injeção seguindo o protocolo relatados 7.
- Transferência de ovos dechorionated em pratos cheios de injeção médio embrião E3.
- Preparar a agulha, e carregar com 2 mL de solução de injeção. Esta solução contém 20 mM PIB FucAl sintetizado chemoenzymatically 8 e tanto Alexa Fluor 594-dextran (5% w / v) como um marcador ou corante vermelho de fenol de carga (0,1% w / v) em 0,2 M KCl. Como controle negativo, substitua-FucAl PIB com o PIB-fucose em solução de injeção.
- Quebrar a agulha e ajustar a pressão de injeção e duração para produzir um 1 gota nL 9.
- Injetar os ovos com 1 nL de uma solução.
- Transferir os ovos em pratos agarose revestidas de petri preenchida com meio embrião E3.
- Incubar os ovos a 28 ° C e remover os ovos não fertilizados dentro de três a quatro horas após a fertilização.
3. BTTES-Cu (I)-Reacção catalisada Clique Química
- Quando os embriões atingem desejado estágios de desenvolvimento (estádio atrasado, por exemplo, a segmentação dos tecidos e larva precoce), revestimento a base de uma placa de 96 poços com agarose.
- Adicionar 92 mL de médio embrião E3 a cada poço, seguido por adição de 4 Alexa Fluor-488 mL de azida (a partir de um estoque de 2,5 mM em H 2 O), 2 mL BTTES-CuSO 4 06:01 complexo, e agitar suavemente para misturar.
- Transferência de embriões no poço contendo o reagente química do clique utilizando um fogo-de vidro polido Pasteur pipeta. Cada poço deve conter menos de cinco embriões.
- Adicionar 2,5 mL de ascorbato de sódio preparada na hora (de um estoque de 100 mm em H 2 O) para iniciar a reação clique em 3. Concentração final de cada reagente: Alexa Fluor azida-488: 100 mm; CuSO 4: 50 mM; BTTES: 300 mM; ascorbato de sódio: 2,5 mM.
- Após 3 min, adicionar 2 mL bathocuproine sulfonato (50 mM de ações em H 2 O), um quelante de cobre biocompatível, para saciar a reação imediatamente, diluir com 100 mL de médio E3 embrião.
- Transferência dos embriões para uma placa de Petri de vidro e lave os embriões tratados duas vezes com 15 mL de médio embrião E3.
4. Imagem
- Coloque uma gota de ultralow ponto de fusão agarose (1,2% (w / v) em meio embrião E3) em um copo prato fundo Mattek micropoços, e colocar um embrião para a queda de agarose.
- Posição dos embriões dorsalmente ou lateralmente e colocar o prato no gelo por 5 min para solidificar a queda de agarose. Adicionar médio embrião E3 suavemente para o prato até cobrir a queda de agarose.
- Imagens de fluorescência de campo e brilhantes são adquiridas seqüencialmente usando um microscópio confocal. Todas as imagens de embriões são adquiridos utilizando um intervalo de passo 5 mm. Figuras compostas são preparadas usando software ImageJ.
5. Resultados representante
A Figura 1 mostra o fluxo de trabalho da nossa estratégia de rotulagem em duas etapas. A Figura 2 mostra a rotulagem de embriões zebrafish via BTTES mediada CuAAC em 9,5 horas pós-fertilização (hpf). BTTES é um tris (triazolylmethyl) ligand amina-based. Ele acelera drasticamente quando CuAAC coordenação com o in situ Cu gerado (I), e promove a reação de cicloadição rapidamente em sistemas vivos sem toxicidade aparente. Imediatamente após uma reação clique em 3-min, que são capazes de detectar etiquetagem robusta dos embriões PIB FucAl tratadas (Figura 2, os painéis à esquerda). Fluorescência de fundo só é detectado para controle de embriões microinjeções PIB-fucose (Figura 2, os painéis à direita).
Figura 1. A estratégia de rotulagem glicanos fucosylated na camada envolvente de embriões zebrafish.
Figura 2. Na geração de imagens in vivo de glicanos fucosylated durante a embriogênese zebrafish via BTTES-Cu (I)-catalisada química do clique. Uma célula-embriões zebrafish estágio são microinjeção com uma dose única do PIB-FucAl e permitiu a develop para 9,5 hpf. Os embriões são, então, reagiu com Alexa Fluor 488 azida-catalisada pela BTTES-Cu (I). Embriões reagiu são gravadas através de microscopia confocal. Máxima intensidade z projeção de imagens de Alexa Fluor 488 fluorescência (painel superior); campo Bright (painel inferior). Barra de escala: 100 mm.
Solução de problemas
| Problema | Causa | Remédio |
| Os embriões olhar insalubres | A solução microinjeção contém contaminantes | A pureza dos açúcares nucleotídeos deverá ser superior a 85%. Verifique a sua fonte. |
| Não há rotulagem após a reação | Concentração de cobre é inferior a 30 mM | Tenha cuidado para não diluir a solução reacção adicionando médio de embriões em excesso E3 ao adicionar os embriões, como a velocidade da reação diminui significativamente quando a concentração de cobre é abaixo de 30 mM. |
| Os embriões morrem após a reação | Manuseio inadequado dos embriões | Verifique se a pipeta é fogo-polido eo vaso de reação é revestido com uma camada muito fina de agarose 0,5%. |
| As imagens parecem irregular | Os reagentes não são devidamente misturados antes de acrescentar os embriões | Seguir a ordem recomendada de adição para os reagentes, e certifique-se que os reagentes química do clique foram devidamente misturados antes de acrescentar os embriões. |
| As imagens mostram os embriões sejam danificados | Agitação vigorosa danos os embriões durante a reação | Agite suavemente para menos de 10 segundos, uma vez que os embriões são a solução. |
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Discussion
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (GM093282 para PW; 3U54AI057158-06S1 a RDS) e fundos de inicialização do Albert Einstein College of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
| Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
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