Summary
Une méthode basée cliquez-chimie qui permet la rapidité, l'étiquetage non invasive, robuste et d'alcyne-taggés glycanes dans des embryons de poisson zèbre est décrite. Glycanes fucosylé dans la couche enveloppant des embryons de poisson zèbre au stade de la gastrulation tardive ont été imagées dans cette étude.
Abstract
Glycanes d'imagerie in vivo a été récemment activé en utilisant une stratégie chimique bioorthogonal journaliste en traitant des cellules ou organismes avec monosaccharides azide ou alcyne-marqués 1, 2. Les monosaccharides modifiés, transformés par la machinerie de biosynthèse glycane, sont incorporés dans les glycoconjugués de surface cellulaire. Les balises bioorthogonal azoture ou alcyne puis laisser conjugaison covalente avec des sondes fluorescentes pour la visualisation, ou avec des sondes d'affinité pour l'enrichissement et l'analyse glycoproteomic. Ce protocole décrit les procédures généralement utilisées pour l'imagerie non invasive des glycanes fucosylé dans embryons de poissons zèbres, notamment: 1) la microinjection d'une cellule embryons au stade avec un PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) l'étiquetage glycanes fucosylé dans la couche enveloppante de embryons de poissons zèbres avec l'azoture de conjugué fluorophores via Cu biocompatible (I)-catalysée azide-alcyne cycloaddition (CuAAC), et 3) l'imagerie par microscopie confocale 3. La méthode décrite ici peut être facilement étendu pour visualiser d'autres catégories de glycanes, glycanes contenant par exemple l'acide sialique 4 et N-acétyl 5, 6, chez le poisson zèbre en développement et dans d'autres organismes vivants.
Protocol
1. Collecte d'oeufs et Dechorionation
- Recueillir et transférer les œufs de poisson zèbre à 35mm boîte de Petri, retirer autant d'eau que possible et ensuite ajouter 1 E Pronease mg / ml dans le milieu d'embryon E3 (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) pour digérer le chorion.
- Après 3-5 minutes, fusionner le plat dans un bécher rempli d'eau les poissons (60 mg "Instant Ocean" par litre distillée H 2 O), et doucement transférer les oeufs dans le bécher et permettre les œufs pour "tomber" dans l'eau.
- Rincer les oeufs avec l'eau du poisson trois fois. La plupart des oeufs seront libérés de leurs chorion.
- Avec une pipette en verre poli au feu Pasteur, transférer les oeufs dechorionated d'agarose revêtement des boîtes de Pétri remplie de milieu d'embryon E3.
2. Microinjection avec un PIB-FucAl
- Préparer les plats après l'injection du protocole rapporté 7.
- Transfert des œufs dans des boîtes d'injection dechorionated remplis de milieu d'embryon E3.
- Préparer l'aiguille, et de la charge avec 2 uL solution injectable. Cette solution contient 20 mM PIB FucAl synthétisé chemoenzymatically 8 et soit Fluor Alexa 594-dextrane (5% p / v) comme un traceur de chargement ou de phénol colorant rouge (0,1% p / v) dans 0,2 M de KCl. Comme témoin négatif, remplacez-le PIB FucAl avec GDP-fucose dans la solution injectable.
- Casser l'aiguille et d'ajuster la pression d'injection et la durée pour obtenir une baisse de 1 nL 9.
- Injecter les oeufs avec 1 nL soit solution.
- Transfert des œufs dans des boîtes de Pétri d'agarose à revêtement remplis de milieu d'embryon E3.
- Incuber les œufs à 28 ° C et enlever les œufs non fécondés dans les trois à quatre heures après la fécondation.
3. BTTES-Cu (I) réaction catalysée par click chemistry
- Lorsque les embryons atteignent désiré stades de développement (par exemple gastrula tardive, la segmentation des tissus et des larves au début), le manteau de la base d'une plaque de 96 puits avec agarose.
- Ajouter 92 pl de milieu d'embryon E3 à chaque puits, suivis par l'addition de 4 ul Alexa Fluor-488 azide (à partir d'un stock de 2,5 mM dans H 2 O), 2 pl BTTES-CUSO4 06:01 complexes, et secouer doucement pour mélanger.
- Transfert des embryons dans le puits contenant le réactif de chimie clic en utilisant un incendie poli pipette Pasteur en verre. Chaque puits doit contenir moins de cinq embryons.
- Ajouter 2,5 ascorbate de sodium fraîchement préparé uL (à partir d'un stock de 100 mM dans H 2 O) pour amorcer la réaction 3 clic. La concentration finale de chaque réactif: Alexa Fluor-488 azoture: 100 pM; CuSO 4: 50 uM; BTTES: 300 uM; ascorbate de sodium: 2,5 mm.
- Après 3 minutes, ajouter 2 bathocuproine uL sulfonate (50 mm Stock dans H 2 O), un chélateur du cuivre biocompatible, pour arrêter la réaction puis diluer immédiatement avec 100 uL moyennes E3 embryon.
- Transfert des embryons à un plat en verre de Pétri et laver les embryons traités deux fois avec 15 ml d'embryon moyennes E3.
4. Imagerie
- Déposer une goutte de la fonte ultra agarose point (de 1,2% (p / v) dans le milieu de l'embryon E3) sur un verre plat en bas de MatTek micropuits, et le lieu d'un embryon dans la goutte d'agarose.
- Position des embryons dorsalement ou latéralement et placer le plat sur la glace pendant 5 min à solidifier la chute d'agarose. Ajouter moyennes embryon E3 doucement le plat jusqu'à ce qu'il recouvre la chute d'agarose.
- Des images de terrain fluorescence et lumineuses sont acquises de façon séquentielle à l'aide d'un microscope confocal. Toutes les images sont acquises embryons en utilisant un intervalle de l'étape 5 um. Chiffres composites sont préparés en utilisant le logiciel ImageJ.
5. Les résultats représentatifs
La figure 1 montre le workflow de notre stratégie d'étiquetage en deux étapes. La figure 2 montre l'étiquetage des embryons de poissons zèbres via BTTES médiée CuAAC à 9,5 heures après fécondation (HPF). BTTES est un phosphate de tris (triazolylmethyl) à base d'amines ligand. Il accélère de façon spectaculaire quand CuAAC coordination avec les in situ généré Cu (I), et favorise la réaction de cycloaddition rapidement dans les systèmes vivants, sans toxicité apparente. Immédiatement après une réaction clic de 3 minutes, nous sommes en mesure de détecter l'étiquetage robuste du PIB embryons-FucAl traitées (figure 2, les panneaux de gauche). Seule la fluorescence de fond est détecté pour le contrôle des embryons micro-injecté avec GDP-fucose (figure 2, les panneaux de droite).
Figure 1. La stratégie de l'étiquetage des glycanes fucosylé dans la couche enveloppant d'embryons de poissons zèbres.
Figure 2. Imagerie in vivo des glycanes fucosylé cours de l'embryogenèse zèbre via BTTES-Cu (I)-catalysée click chemistry. Une cellule embryons de poissons zèbres stade sont microinjectés avec une dose unique du PIB-FucAl et autorisés à déveop à 9,5 HPF. Les embryons sont ensuite mis à réagir avec Alexa Fluor 488 azoture-catalysée par BTTES-Cu (I). Embryons réagi sont imagées par microscopie confocale. Intensité maximale z-projection des images de fluorescence Alexa Fluor 488 (panneau supérieur); Fond clair (panneau inférieur). Barre d'échelle: 100 um.
Dépannage
| Problème | Cause | Remède |
| Les embryons aspect maladif | La solution contient des contaminants microinjectés | La pureté des sucres nucléotides doit être supérieure à 85%. Vérifiez vos sources. |
| Il n'ya pas d'étiquetage après la réaction | La concentration en cuivre est inférieure à 30 uM | Soyez prudent de ne pas diluer la solution de réaction en ajoutant un excès moyennes embryon E3 lors de l'ajout des embryons, comme la vitesse de réaction diminue considérablement lorsque la concentration en cuivre est inférieure à 30 uM. |
| Les embryons meurent après la réaction | Une mauvaise manipulation des embryons | Assurez-vous que la pipette est polie au feu et le réacteur est recouvert d'une couche très mince de 0,5% d'agarose. |
| Les images sont inégale | Les réactifs ne sont pas correctement mélangés avant d'ajouter que les embryons | Suivez l'ordre recommandé d'addition pour les réactifs, et s'assurer que les réactifs de chimie clic ont été correctement mélangés avant d'ajouter les embryons. |
| Les images montrent les embryons sont endommagés | Agitation vigoureuse dommages des embryons lors de la réaction | Secouez doucement pour moins de 10 secondes une fois les embryons sont dans la solution. |
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Discussion
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été partiellement financé par le National Institutes of Health (GM093282 à PW; 3U54AI057158-06S1 à RDS) et les fonds de démarrage de l'Albert Einstein College of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
| Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R.
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D. Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans. J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).
- Chang, P. V. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. , (2009).
- Wang, W. Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. , (2009).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
