Summary
एक क्लिक रसायन आधारित पद्धति है कि तेजी से, zebrafish भ्रूण में alkyne टैग glycans की noninvasive, और मजबूत लेबलिंग के लिए अनुमति देता है वर्णित है. इस अध्ययन में देर gastrulation चरण में zebrafish भ्रूण के घेर परत में Fucosylated glycans imaged थे.
Abstract
हाल ही में vivo में इमेजिंग glycans azide या alkyne टैग 1 monosaccharides, 2 के साथ कोशिकाओं या जीवों के इलाज के द्वारा किया गया एक bioorthogonal रासायनिक संवाददाता रणनीति का उपयोग सक्षम है. संशोधित monosaccharides, glycan biosynthetic मशीनरी द्वारा संसाधित, कोशिका की सतह glycoconjugates में शामिल हैं. bioorthogonal azide या alkyne टैग तो सहसंयोजक संयुग्मन दृश्य के लिए फ्लोरोसेंट जांच के साथ की अनुमति है, या संवर्धन और glycoproteomic विश्लेषण के लिए आत्मीयता जांच के साथ. इस प्रोटोकॉल आमतौर पर zebrafish भ्रूण में fucosylated glycans की noninvasive इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं सहित वर्णन: 1) सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी FucAl) 5 - alkynylfucose, 2 के साथ एक सेल चरण भ्रूण के microinjection) घेर की परत में fucosylated glycans लेबलिंग biocompatible है घन (आई) - उत्प्रेरित cycloaddition azide-alkyne (CuAAC), और confocal माइक्रोस्कोपी 3 के द्वारा) 3 इमेजिंग के माध्यम से azide संयुग्मित fluorophores के साथ zebrafish भ्रूण . विधि यहाँ वर्णित आसानी से हो glycans के अन्य वर्गों, जैसे glycans सियालिक एसिड 4 और 5 एन acetylgalactosamine, 6 युक्त, विकासशील zebrafish में और अन्य जीवित जीवों में कल्पना करने के लिए विस्तारित कर सकते हैं.
Protocol
1. अंडे संग्रह और Dechorionation
- लीजिए और 35 मिमी पेट्री डिश zebrafish अंडे हस्तांतरण करने के लिए, संभव के रूप में ज्यादा पानी के रूप में हटा दें और फिर 1 मिलीग्राम / एमएल E3 भ्रूण मध्यम में Pronease ई (5 मिमी NaCl, 0.17 मिमी KCl, .33 मिमी 2 CaCl 2 2H · हे , 0.33 मिमी MgSO जोड़ने 4, 7.4 = पीएच) chorion पचाने में.
- 3-5 मिनट के बाद, एक मछली पानी (60 मिलीग्राम प्रति लीटर "त्वरित महासागर" आसुत एच 2 हे) से भरा बीकर में पकवान मर्ज करते हैं, और धीरे से बीकर अंडे और अंडे पानी में "गिर" हस्तांतरण की अनुमति .
- मछली पानी तीन बार के साथ अंडे कुल्ला. अधिकांश अंडे उनके chorion से जारी किया जाएगा.
- एक आग पॉलिश कांच पाश्चर विंदुक का प्रयोग, agarose लेपित पेट्री E3 भ्रूण माध्यम से भरा बर्तन dechorionated अंडे हस्तांतरण.
2. सकल घरेलू उत्पाद - FucAl साथ Microinjection
- रिपोर्ट 7 प्रोटोकॉल के बाद इंजेक्शन व्यंजन तैयार .
- इंजेक्शन E3 भ्रूण माध्यम से भरा बर्तन में dechorionated अंडे का स्थानांतरण.
- सुई तैयार है, और 2 μL इंजेक्शन समाधान के साथ लोड. यह समाधान एक अनुरेखक या phenol 0.2 एम KCl में लाल लोडिंग डाई (0.1% w / v) के रूप में 20 मिमी सकल घरेलू उत्पाद - FucAl 8 chemoenzymatically संश्लेषित और भी Alexa dextran 594 (5% w / v) Fluor शामिल हैं. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, सकल घरेलू उत्पाद - fucose के साथ इंजेक्शन के समाधान में सकल घरेलू उत्पाद - FucAl जगह.
- सुई तोड़ और इंजेक्शन के दबाव और अवधि के लिए एक 1 NL 9 ड्रॉप उपज समायोजित.
- 1 NL या तो समाधान के साथ अंडे इंजेक्षन.
- Agarose लेपित पेट्री E3 भ्रूण माध्यम से भरा बर्तन में अंडे का स्थानांतरण.
- 28 डिग्री सेल्सियस पर अंडों को सेते हैं और निषेचन के बाद तीन से चार घंटे के भीतर अंडे unfertilized हटायें.
3. (मैं) BTTES घन उत्प्रेरित क्लिक करें रसायन विज्ञान रिएक्शन
- जब भ्रूण विकास चरणों (जैसे देर गेसट्रुला, ऊतक विभाजन और जल्दी लार्वा) agarose के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली के बेस कोट वांछित तक पहुँचने.
- प्रत्येक अच्छी तरह से 92 μL E3 भ्रूण मध्यम जोड़ें, 4 μL एलेक्सा Fluor 488 azide के अलावा द्वारा पीछा किया (एच 2 हे में एक 2.5 मिमी शेयर से), 2 μL BTTES CuSO चार 06:01 जटिल, और धीरे से मिलाने के लिए मिश्रण .
- क्लिक करें रसायन विज्ञान अभिकर्मक का उपयोग कर एक आग पॉलिश कांच पाश्चर विंदुक युक्त अच्छी तरह से में भ्रूण स्थानांतरण. हर अच्छी तरह से कम से कम पाँच भ्रूण को शामिल करना चाहिए.
- 2.5 μL हौसले से तैयार सोडियम एस्कॉर्बेट (एच 2 हे में एक 100 मिमी स्टॉक से) क्लिक करें 3 प्रतिक्रिया आरंभ जोड़ें . प्रत्येक अभिकर्मक के अंतिम एकाग्रता: एलेक्सा Fluor 488 azide: 100 सुक्ष्ममापी, 4 CuSO: 50 सुक्ष्ममापी, BTTES: 300 सुक्ष्ममापी, सोडियम ascorbate: 2.5 मिमी.
- 3 मिनट के बाद, 2 μL bathocuproine sulphonate (एच 2 हे में 50 मिमी शेयर), एक biocompatible तांबे chelator जोड़ने के लिए, प्रतिक्रिया तो बुझाने 100 μL E3 भ्रूण मध्यम के साथ तुरंत पतला.
- एक गिलास पेट्री डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण और इलाज भ्रूण 15 एमएल E3 भ्रूण मध्यम के साथ 2 बार धो लो.
4. इमेजिंग
- MatTek गिलास नीचे microwell पकवान पर ultralow गलनांक agarose (E3 भ्रूण मध्यम में 1.2% (w / v)) की एक बूंद प्लेस, और agarose ड्रॉप में एक भ्रूण जगह.
- भ्रूण dorsally या पार्श्व स्थिति और 5 agarose ड्रॉप जमना मिनट के लिए बर्फ पर पकवान जगह. E3 भ्रूण मध्यम धीरे डिश के लिए जब तक agarose ड्रॉप शामिल जोड़ें.
- प्रतिदीप्ति और चमकीले क्षेत्र छवियों sequentially एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कर हासिल किया है. सभी भ्रूण छवियों को एक 5 सुक्ष्ममापी कदम अंतराल का उपयोग करके प्राप्त कर रहे हैं. समग्र आंकड़े ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए तैयार हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 हमारे लेबलिंग दो कदम रणनीति के वर्कफ़्लो से पता चलता है. चित्रा 2 9.5 घंटे पोस्ट निषेचन (HPF) CuAAC BTTES की मध्यस्थता के माध्यम से zebrafish भ्रूण की लेबलिंग से पता चलता है. BTTES एक tris (triazolylmethyl) ligand amine आधारित है. यह नाटकीय रूप से CuAAC accelerates जब में सीटू उत्पन्न घन (मैं) के साथ समन्वय, और cycloaddition प्रतिक्रिया तेजी से स्पष्ट विषाक्तता के बिना रहने वाले सिस्टम में बढ़ावा देता है. तुरंत एक क्लिक 3 मिनट प्रतिक्रिया के बाद, हम सकल घरेलू उत्पाद - FucAl इलाज भ्रूण की मजबूत लेबलिंग (चित्रा 2, बाएँ पैनलों) का पता लगाने में सक्षम हैं. केवल पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति नियंत्रण सकल घरेलू उत्पाद (जीडीपी) fucose (चित्रा 2, सही पैनलों) के साथ microinjected भ्रूण के लिए पता चला है.
चित्रा 1 zebrafish भ्रूण की परत घेर में fucosylated glycans लेबलिंग की रणनीति.
2 (मैं) BTTES घन - उत्प्रेरित क्लिक करें रसायन विज्ञान के माध्यम से zebrafish embryogenesis दौरान fucosylated glycans के vivo इमेजिंग में चित्रा. सकल घरेलू उत्पाद - FucAl की एक खुराक के साथ एक सेल मंच zebrafish भ्रूण microinjected हैं और गतिविधियों के लिए अनुमति दी9.5 HPF के लिए सेशन. भ्रूण तो Alexa 488 azide द्वारा उत्प्रेरित Fluor BTTES - घन (आई) के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त कर रहे हैं. प्रतिक्रिया व्यक्त की भ्रूण confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग imaged हैं. उज्ज्वल क्षेत्र (कम पैनल); Alexa 488 Fluor प्रतिदीप्ति (ऊपरी पैनल) की अधिकतम तीव्रता Z प्रक्षेपण छवियों. स्केल पट्टी: 100 सुक्ष्ममापी.
समस्या निवारण
| समस्या | कारण | उपाय |
| भ्रूण अस्वस्थ देखो | microinjected समाधान contaminants के शामिल | nucleotide शर्करा की शुद्धता 85% से अधिक होना चाहिए. अपने स्रोत की जाँच करें. |
| प्रतिक्रिया के बाद कोई लेबलिंग | कॉपर एकाग्रता नीचे 30 सुक्ष्ममापी है | अतिरिक्त E3 भ्रूण मध्यम जोड़ने जब भ्रूण जोड़ने, के रूप में प्रतिक्रिया की दर काफी बूँदें जब तांबे एकाग्रता नीचे 30 सुक्ष्ममापी प्रतिक्रिया समाधान नहीं पतला सावधान रहो. |
| भ्रूण प्रतिक्रिया के बाद मर जाते हैं | भ्रूण की अनुचित हैंडलिंग | सुनिश्चित करें कि आग पॉलिश pipet है और प्रतिक्रिया पोत 0.5% agarose का एक बहुत पतली परत के साथ लेपित है. |
| छवियों धब्बेदार देखो | अभिकर्मकों भ्रूण जोड़ने से पहले ठीक से नहीं मिलाया जाता है | अभिकर्मकों के लिए इसके अलावा की सिफारिश क्रम का पालन करें, और यकीन है कि क्लिक करें रसायन विज्ञान अभिकर्मकों ठीक किया गया है से पहले भ्रूण जोड़ने मिश्रित. |
| छवियों को दिखाने के भ्रूण क्षतिग्रस्त कर रहे हैं | जोरदार नुकसान मिलाते प्रतिक्रिया के दौरान भ्रूण | धीरे कम से कम 10 सेकंड के लिए हिला एक बार भ्रूण समाधान में हैं. |
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Discussion
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
और मेडिसिन के अल्बर्ट आइंस्टीन कॉलेज से स्टार्टअप धन, इस काम आंशिक रूप से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (RDS 3U54AI057158-06S1 GM093282 पीडब्लू) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
| Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
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