Summary
Ett klick-kemi baserad metod som möjliggör en snabb, icke-invasiv, och robust märkning av alkyne-märkta glykaner i zebrafisk embryon beskrivs. Fucosylated glykaner i de omgivande lager av zebrafisk embryon i slutet gastrulation skede fanns avbildad i denna studie.
Abstract
Imaging glycans in vivo har nyligen blivit möjligt tack vare en bioorthogonal strategi kemiska reporter genom att behandla celler eller organismer med azide-eller alkyne-taggade monosackarider 1, 2. Den modifierade monosackarider, bearbetas av glycan biosyntetiska maskiner, ingår i Glycoconjugates cellytan. Den bioorthogonal azide eller alkyne taggar kan sedan kovalenta konjugering med fluorescerande prober för visualisering, eller med affinitet givare för anrikning och glycoproteomic analys. Detta protokoll beskriver de förfaranden som vanligtvis används för icke-invasiv avbildning av fucosylated glykaner i zebrafisk embryon, inklusive: 1) mikroinjektion av en-cells embryon skede med BNP-5-alkynylfucose (BNP-FucAl), 2) märkning fucosylated glykaner i kuvertering lagret av zebrafisk embryon med azide-konjugerad fluoroforer via biokompatibla Cu (I)-katalyserad azide-alkyne cycloaddition (CuAAC), och 3) avbildning av konfokalmikroskopi 3. Den metod som beskrivs här kan lätt utvidgas till att visualisera andra grupper av glykaner, t.ex. glycans innehåller sialinsyra 4 och N-acetylgalaktosamin 5, 6, utveckla zebrafisk och andra levande organismer.
Protocol
1. Insamling av ägg och Dechorionation
- Samla in och överföra zebrafisk ägg till 35 mm petriskål, ta bort så mycket vatten som möjligt och sedan lägga till 1 mg / ml Pronease E i E3 embryo medelstora (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) att smälta chorion.
- Efter 3-5 minuter, slå ihop skålen i en bägare fylld med fisk vatten (60 mg "instant Ocean" per liter destillerat H 2 O), och försiktigt överföra ägg till bägare och låt äggen att "falla" i vattnet.
- Skölj äggen med fisk vattnet tre gånger. De flesta äggen kommer att släppas från sina chorion.
- Med hjälp av en brand-polerat glas pasteurpipett, överföra dechorionated ägg till agaros-belagda petriskålar fyllda med E3 embryo medium.
2. Mikroinjektion med BNP-FucAl
- Förbered injektionen rätter efter rapporteringsperioden protokoll 7.
- Överför dechorionated äggen i injektion rätter fylld med E3 embryo medium.
- Förbered nål, och ladda med 2 mikroliter injektionslösning. Denna lösning innehåller 20 mM BNP-FucAl syntetiseras chemoenzymatically 8 och antingen Alexa Fluor 594-dextran (5% w / v) som ett spårämne eller fenolrött laddningsfärg (0,1% w / v) i 0,2 M KCl. Som en negativ kontroll, ersätta BNP-FucAl med BNP-fukos i injektionslösning.
- Bryt nålen och justera insprutningstryck och varaktighet för att ge en 1 NL droppe 9.
- Injicera ägg med 1 NL av antingen lösning.
- Överför äggen i agarosen-belagd petriskålar fyllda med E3 embryo medium.
- Inkubera ägg vid 28 ° C och ta bort obefruktade ägg inom tre till fyra timmar efter befruktningen.
3. BTTES-Cu (I)-katalyserad Klicka kemi reaktionsteknik
- När embryona når önskad utvecklingsstadier (t.ex. sena gastrula, mjukpapper segmentering och tidiga larv), päls basen av en 96-brunnar med agaros.
- Tillsätt 92 mikroliter E3 embryo i varje brunn, följt av tillsats av 4 mikroliter Alexa Fluor-488 Natriumazid (från ett 2,5 mm lager i H 2 O), 2 mikroliter BTTES-CuSO 4 06:01 komplex, och skaka försiktigt för att blanda.
- Överför embryon i brunnen innehåller reagens klicka kemi med en brand-polerat glas pasteurpipett. Varje brunn bör innehålla mindre än fem embryon.
- Tillsätt 2,5 mikroliter nygjord natriumaskorbat (från en 100 mm lager i H 2 O) att inleda klicka reaktion 3. Slutlig koncentration av varje reagens: Alexa Fluor-488 azide: 100 mikroM; CuSO 4: 50 mikroM; BTTES: 300 mikroM; natriumaskorbat: 2,5 mm.
- Efter 3 min, tillsätt 2 mikroliter bathocuproine sulfonat (50 mm lager i H 2 O), ett biokompatibelt koppar kelator, för att släcka en reaktion sedan späd omedelbart med 100 mikroliter E3 embryo medium.
- Överför embryon till ett glas petriskål och tvätta den behandlade embryon 2 gånger med 15 ml E3 embryo medium.
4. Imaging
- Placera en droppe ultralåga smältpunkt Agar (1,2% (w / v) i E3 embryo medium) på en Mattek glas botten brunn maträtt, och placera ett embryo till agarosen droppe.
- Placera embryon dorsalt eller sidled och placera skålen på is i 5 min för att stelna i agaros droppe. Lägg E3 embryo medelstora försiktigt i skålen tills den täcker agarosen droppe.
- Fluorescens och ljusa fält bilder förvärvas sekventiellt med hjälp av en konfokalmikroskop. Alla embryo bilder förvärvas med hjälp av en 5 ìm steg intervall. Komposit siffror är beredda att använda ImageJ programvara.
5. Representativa resultat
Figur 1 visar arbetsflödet av våra två steg märkning strategi. Figur 2 visar märkning av zebrafisk embryon via BTTES-medierade CuAAC till 9,5 timmar efter befruktning (HPF). BTTES är en tris (triazolylmethyl) amin-baserade ligand. Den accelererar CuAAC dramatiskt när samordna med i genererade situ Cu (I), och främjar cycloaddition reaktionen snabbt i levande system utan uppenbar toxicitet. Omedelbart efter en 3-minuter klicka reaktion, kan vi upptäcka robusta märkning av de behandlade BNP-FucAl embryon (Figur 2, vänster paneler). Endast bakgrundsfluorescens upptäcks för kontroll embryon idag injiceras med BNP-fukos (Figur 2, höger sida).
Figur 1. Strategin för märkning fucosylated glykaner i de omgivande lager av zebrafisk embryon.
Figur 2. In vivo avbildning av fucosylated glycans under zebrafisk embryogenesen via BTTES-Cu (I)-katalyserad klicka kemi. En cell skede zebrafisk embryon idag injiceras med en engångsdos av BNP-FucAl och tillåtas att utvecklasop till 9,5 HPF. Embryona då reagerade med Alexa Fluor 488-azide katalyseras av BTTES-Cu (I). Reagerade embryon avbildas med konfokalmikroskopi. Maximal stödnivå z-projektion bilder av Alexa Fluor 488 fluorescens (övre panelen), Bright fält (undre panelen). Skala bar: 100 ìm.
Felsökning
| Problem | Orsak | Remedy |
| Embryona ser ohälsosamma | Den idag injiceras lösningen innehåller föroreningar | Renheten av nukleotid sockerarter bör vara större än 85%. Kontrollera din källa. |
| Det finns ingen märkning efter reaktion | Koppar koncentrationen är under 30 mikroM | Var noga med att inte späda reaktionen lösningen genom att tillsätta överskott medelstora E3 embryo när du lägger embryona, som reaktionshastigheten minskar kraftigt när koppar koncentrationen är under 30 mikroM. |
| Embryona dör efter reaktion | Felaktig hantering av embryona | Se till att pipettera är brand-polerad och reaktionen fartyget är belagt med ett mycket tunt lager av 0,5% agaros. |
| Bilderna ser fläckig | Reagensen är inte riktigt blandas innan du lägger de embryon | Följ den rekommenderade ordningen för tillägg för reagenser, och se till att klicka på kemin reagens riktigt har blandats innan du lägger till embryon. |
| Bilderna visar embryona är skadade | Kraftig skakning förstör embryon under reaktionen | Skaka försiktigt för mindre än 10 sekunder när embryona i lösningen. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har delvis stöd av National Institutes of Health (GM093282 till PW, 3U54AI057158-06S1 till RDS) och start medel från Albert Einstein College of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
| Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R.
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D. Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans. J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).
- Chang, P. V. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. , (2009).
- Wang, W. Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. , (2009).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
