Summary
Un método de hacer clic química base que permite el etiquetado rápido, no invasivo, y robusto de alquino con etiquetas glicanos en embriones de pez cebra se describe. Glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra en la etapa de gastrulación finales fueron estudiados en este estudio.
Abstract
Glicanos de imágenes en vivo ha sido recientemente habilitada mediante una estrategia de química reportero bioorthogonal por el tratamiento de las células u organismos con los monosacáridos azida o alquino etiquetados-1, 2. Los monosacáridos modificados, procesados por la maquinaria biosintética de glicanos, se incorporan a glicoconjugados de la superficie celular. Las etiquetas bioorthogonal azida o alquino luego permitir que la conjugación covalente con sondas fluorescentes para la visualización, o con sondas de afinidad para el enriquecimiento y el análisis glycoproteomic. Este protocolo describe los procedimientos que normalmente se utiliza para obtener imágenes no invasivo de los glicanos fucosilados en embriones de pez cebra, incluyendo: 1) la microinyección de una célula de embriones etapa con el PIB-5-alkynylfucose (PIB FucAl), 2) El etiquetado glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra con azida fluoróforos conjugados a través de Cu biocompatible (I) catalizada por azida-alquino cicloadición (CuAAC), y la imagen 3) por microscopía confocal 3. El método descrito aquí puede extenderse fácilmente para visualizar las otras clases de glicanos, por ejemplo, los glicanos que contienen ácido siálico 4 y N-acetilgalactosamina 5, 6, en el pez cebra en desarrollo y en otros organismos vivos.
Protocol
1. Recolección de huevos y Dechorionation
- Recoger y traspasar los huevos de pez cebra a 35 mm placa de Petri, eliminar la mayor cantidad de agua posible y luego agregar 1 mg / ml en el medio de E Pronease embrión E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 · 2H 2 O, 0,33 mM MgSO 4, pH = 7,4) para digerir el corion.
- Después de 3-5 minutos, combinar el plato en un vaso lleno de peces de agua (60 mg "Ocean instantánea" por litro de H2O destilada), y suavemente la transferencia de los huevos en el vaso y permitir que los huevos se "caen" en el agua.
- Enjuague los huevos con los peces de agua tres veces. La mayoría de los huevos serán liberados de sus corion.
- El uso de un pulido al fuego pipeta Pasteur de vidrio, la transferencia de los huevos dechorionated de agarosa recubiertas placas de Petri llenas de un medio de embriones E3.
2. Microinyección con el PIB-FucAl
- Prepare los platos después de la inyección del protocolo reportado 7.
- La transferencia de los huevos en platos dechorionated inyección llena con un medio de embriones E3.
- Prepare la aguja, y la carga con 2 l de inyección de solución. Esta solución contiene 20 mM PIB FucAl sintetizado chemoenzymatically 8 y sea Alexa Fluor 594-dextrano (5% w / v) como trazador o rojo fenol del colorante de carga (0,1% w / v) en 0,2 M de KCl. Como control negativo, sustituir el PIB FucAl con GDP-fucosa en solución inyectable.
- Romper la aguja y ajustar la presión de inyección y la duración para producir una caída de 1 nL 9.
- Inyectar los huevos con una latitud norte de cualquiera de las soluciones.
- La transferencia de los huevos en agarosa recubiertas placas de Petri llenas de un medio de embriones E3.
- Incubar los huevos a 28 ° C y retirar los óvulos no fecundados dentro de tres o cuatro horas después de la fecundación.
3. BTTES-Cu (I)-reacción catalizada Química Haga clic en
- Cuando los embriones alcance deseado etapas de desarrollo (por ejemplo, a finales de gástrula, la segmentación del tejido y la larva antes de tiempo), capa de la base de una placa de 96 pocillos con agarosa.
- Agregar 92 l medio embrión E3 a cada pocillo, seguido por la adición de 4 l Alexa Fluor-488 azida (de una población de 2,5 mm de H 2 O), 2 l BTTES-CuSO 4 complejos 6:1, y agitar suavemente para mezclar.
- La transferencia de embriones en el pozo que contiene el reactivo químico, haga clic con el fuego-pulido de vidrio pipeta Pasteur. Cada pocillo debe contener menos de cinco embriones.
- Añadir 2,5 l de ascorbato de sodio recién preparada (a partir de un stock de 100 mM de H 2 O) para iniciar la reacción, haga clic 3. La concentración final de cada reactivo: Alexa Fluor-488 azida: 100 M; CuSO 4: 50 M; BTTES: 300 M; ascorbato de sodio: 2,5 mm.
- Después de 3 minutos, añadir 2 l bathocuproine sulfonato (50 mM de existencias en el H 2 O), un quelante de cobre biocompatible, para detener la reacción y luego se diluye de inmediato con 100 l medio embrión E3.
- La transferencia de los embriones a un plato de Petri de vidrio y lavado de los embriones tratados dos veces con 15 ml de medio embrión E3.
4. Imágenes
- Coloque una gota de ultra punto de fusión de agarosa (1,2% (w / v) en medio de embrión E3) en un vaso MatTek plato de fondo de micropocillos, y el lugar de un embrión en la caída de agarosa.
- Posición de los embriones dorsal o lateral y colocar el plato en hielo durante 5 min para solidificar la caída de agarosa. Añadir medio embrión E3 suavemente el plato hasta que cubra la baja de agarosa.
- Imágenes de fluorescencia de campo y brillante se adquieren de forma secuencial con un microscopio confocal. Todas las imágenes de embriones se obtienen con un intervalo de paso de 5 micras. Figuras compuestas se preparan utilizando el software ImageJ.
5. Resultados representante
La figura 1 muestra el flujo de trabajo de nuestra estrategia de etiquetado de dos pasos. La figura 2 muestra el etiquetado de los embriones de pez cebra a través de BTTES mediada CuAAC a 9,5 horas después de la fecundación (HPF). BTTES es un tris (triazolylmethyl) basado en amina ligando. Acelera CuAAC dramáticamente cuando la coordinación con el generado in situ Cu (I), y promueve la rápida reacción de cicloadición de los sistemas vivos, sin aparente toxicidad. Inmediatamente después de una reacción clic en 3-min, que son capaces de detectar el etiquetado de los embriones robusto del PIB-FucAl tratados (Figura 2, panel izquierdo). Fluorescencia de fondo sólo se detecta para los embriones de control de microinyección con GDP-fucosa (Figura 2, paneles de la derecha).
Figura 1. La estrategia de etiquetado glicanos fucosilados en la capa envolvente de embriones de pez cebra.
Figura 2. En imágenes in vivo de los glicanos fucosilados durante la embriogénesis del pez cebra a través de BTTES-Cu (I) catalizada por la química haga clic. Uno de células de embriones de pez cebra etapa son microinyección con una sola dosis del PIB-y se permite que FucAl desarrolloop a 9,5 HPF. Los embriones se hace reaccionar con Alexa Fluor 488-azida catalizada por BTTES-Cu (I). Embriones se reaccionó utilizando imágenes de microscopía confocal. Intensidad máxima de z de proyección de imágenes de fluorescencia de Alexa Fluor 488 (panel superior); campo brillante (panel inferior). Barra de escala: 100 micras.
Solución de problemas
| Problema | Causa | Remedio |
| Los embriones parece estar enferma | La solución microinyección contiene contaminantes | La pureza de los azúcares nucleótidos debe ser superior al 85%. Revise la fuente. |
| No hay ninguna etiqueta después de la reacción | La concentración de cobre es inferior a 30 micras | Tenga cuidado de no diluir la solución de reacción mediante la adición de un exceso de embriones medio E3 cuando se agregan los embriones, como la velocidad de reacción disminuye significativamente cuando la concentración de cobre es inferior a 30 micras. |
| Los embriones mueren después de la reacción | Un manejo inadecuado de los embriones | Asegúrese de que la pipeta está pulido al fuego y el recipiente de reacción está recubierta con una capa muy delgada de 0,5% de agarosa. |
| Las imágenes parecen irregular | Los reactivos no están bien mezclados antes de añadir los embriones | Siga el orden recomendado de la adición de los reactivos, y asegurarse de que los reactivos de química, haga clic hayan sido debidamente mezclado antes de agregar los embriones. |
| Las imágenes muestran que los embriones son dañados | Agitación vigorosa daños a los embriones durante la reacción | Agite con cuidado por menos de 10 segundos una vez que los embriones se encuentran en la solución. |
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Discussion
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue parcialmente financiado por los Institutos Nacionales de Salud (GM093282 a PW; 3U54AI057158-06S1 de RDS) y los fondos de puesta en marcha de Albert Einstein College of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
| Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
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