Summary
يوصف أسلوب النقر على الكيمياء التي تسمح لوضع العلامات وسريع موسع ، وقوية من آلكاين الموسومة glycans في الأجنة الزرد. وقد التقط glycans Fucosylated في طبقة التغليف الأجنة الزرد في مرحلة تكون المعيدة في وقت متأخر من هذه الدراسة.
Abstract
وقد تم مؤخرا glycans التصوير في فيفو تمكين باستخدام مراسل الكيميائية bioorthogonal الاستراتيجية عن طريق علاج الخلايا أو الكائنات الحية مع السكريات الأحادية أو أزيد آلكاين الموسومة - 1 ، 2. أدرجت تعديل السكريات الأحادية ، التي تتم معالجتها بواسطة آلات السكروز غليكان ، في glycoconjugates سطح الخلية. وbioorthogonal أزيد أو السماح به آلكاين ثم اقتران التساهمية مع تحقيقات نيون للالتصور ، أو تقارب مع تحقيقات وتحليلات لتخصيب glycoproteomic. يصف هذا البروتوكول الإجراءات التي تستخدم عادة لتصوير موسع من glycans fucosylated في الأجنة الزرد ، ومنها : 1) microinjection أحد خلايا الأجنة المسرح مع الناتج المحلي الإجمالي alkynylfucose - 5 (الناتج المحلي الإجمالي FucAl) ، 2) وضع العلامات glycans fucosylated في طبقة من يغلف الزرد الأجنة ، مترافق مع آزيد fluorophores حيويا عبر النحاس (I) المحفزة آزيد - آلكاين الحلقيه (CuAAC) ، والتصوير 3) بواسطة المجهر مبائر 3. يمكن أن يكون الأسلوب هو موضح هنا مدد بسهولة إلى فئات أخرى من تصور glycans ، glycans مثل التي تحتوي على حمض السياليك 4 و N - acetylgalactosamine 5 ، 6 ، في البلدان النامية والزرد في الكائنات الحية الأخرى.
Protocol
1. جمع البيض وDechorionation
- جمع ونقل البيض إلى طبق بتري الزرد 35mm ، كما إزالة أكبر قدر ممكن من المياه ثم إضافة 1 E Pronease ملغم / لتر في المتوسط الجنين E3 (5 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 0.17 ملي بوكل ، 0.33 ملي CaCl 2 · 2H 2 O ، 0.33 ملي MgSO 4 ، ودرجة الحموضة = 7.4) لهضم المشيماء.
- بعد 3-5 دقائق ، دمج الطبق في دورق مملوء بالماء الأسماك (60 ملغ "المحيط لحظة" للتر الواحد المقطر H 2 O) ، ونقل البيض برفق إلى الدورق والسماح للبيض الى "سقوط" في المياه.
- شطف مع بيض أسماك المياه ثلاث مرات. وسيتم اطلاق سراح معظمهم من البيض المشيماء بهم.
- باستخدام ماصة باستير النار المصقول والزجاج ، ونقل البيض إلى أطباق بتري dechorionated agarose المغلفة مليئة المتوسطة الجنين E3.
2. Microinjection مع الناتج المحلي الإجمالي FucAl
- إعداد أطباق الحقن بعد بروتوكول أفادت 7.
- نقل إلى أطباق البيض dechorionated حقنة مليئة المتوسطة الجنين E3.
- إعداد الإبرة ، وتحميلها مع حقن محلول 2 ميكرولتر. هذا الحل يحتوي على 20 ملي الناتج المحلي الإجمالي FucAl توليفها chemoenzymatically (8) وإما فلور اليكسا 594 - ديكستران (5 ٪ ث / ت) باعتبارها المذنبة أو صبغ أحمر الفينول التحميل (0.1 ٪ W / V) في بوكل M 0.2. كعنصر تحكم السلبية ، استبدال الناتج المحلي الإجمالي FucAl مع الناتج المحلي الإجمالي في حل فوكوز الحقن.
- كسر الإبرة وضبط ضغط الحقن والمدة إلى انخفاض العائد NL 1 9.
- حقن البيض مع 1 NL إما حل.
- نقل البيض في أطباق بتري agarose المغلفة مليئة المتوسطة الجنين E3.
- احتضان البيض عند 28 درجة مئوية وإزالة بويضة غير مخصبة في غضون ثلاث إلى أربع ساعات بعد الإخصاب.
3. BTTES النحاس (I) المحفزة الرد اضغط الكيمياء
- عندما تصل إلى المطلوب من مراحل تطور الأجنة (المعيدة في وقت متأخر مثلا ، وتجزئة النسيج واليرقة المبكر) ، ومعطف قاعدة لوحة 96 - جيدا مع agarose.
- إضافة 92 ميكرولتر المتوسطة الجنين E3 إلى كل بئر ، تليها إضافة 4 آزيد اليكسا ميكرولتر - 488 فلور (من المخزون 2.5 ملم في H 2 O) ، و 2 ميكرولتر BTTES - 4 كبريتات النحاس المعقدة 6:1 ، ويهز بلطف إلى المزيج.
- نقل الأجنة في البئر تحتوي على كاشف الكيمياء فوق باستخدام الزجاج المصقول النار باستور ماصة. وينبغي أن كل بئر تحتوي على أقل من خمسة أجنة.
- إضافة 2.5 ميكرولتر أسكوربات الصوديوم الطازجة (من 100 مم في الأسهم H 2 O) لبدء رد فعل فوق 3. نهائي تركيز كل الكاشف : اليكسا فلور - 488 آزيد : 100 ميكرومتر ؛ كبريتات النحاس (4) : 50 ميكرومتر ؛ BTTES : 300 ميكرومتر ؛ أسكوربات الصوديوم : 2.5 مم.
- بعد 3 دقائق ، إضافة 2 ميكرولتر سلفونات bathocuproine (50 ملم في الأسهم H 2 O) ، والنحاس خالب حيويا ، لإرواء رد فعل على الفور ثم تمييع مع 100 ميكرولتر E3 المتوسطة الجنين.
- نقل الأجنة إلى طبق بتري والزجاج ، وغسل الأجنة المعالجة 2 مرات مع 15 مل المتوسطة الجنين E3.
4. التصوير
- وضع قطرة من نقطة ذوبان agarose ultralow (1.2 ٪ (W / V) في وسط جنين E3) على طبق زجاج ماتيك microwell القاع ، ووضع الجنين في انخفاض agarose.
- موقف الأجنة ظهريا أو أفقيا ووضع الطبق على الجليد لمدة 5 دقائق لترسيخ انخفاض agarose. إضافة E3 المتوسطة الجنين بلطف على طبق حتى يغطي انخفاض agarose.
- يتم الحصول على صور مشرقة ومضان الحقل باستخدام المجهر مبائر بالتسلسل. يتم الحصول على جميع الصور الجنين باستخدام الفاصلة الخطوة 5 ميكرون. وتعد الأرقام المركبة باستخدام ImageJ البرمجيات.
5. ممثل النتائج
الشكل 1 يوضح سير العمل في استراتيجيتنا وسم من خطوتين. الشكل 2 يبين وسم الأجنة الزرد عبر BTTES بوساطة CuAAC الإخصاب عند 9.5 آخر ساعة (HPF). BTTES هو (triazolylmethyl) تريس أمين المستندة يجند. انها تسارع بشكل كبير عندما CuAAC التنسيق مع النحاس ولدت في الموقع (I) ، ويشجع على التفاعل الحلقيه بسرعة في المنظومات الحية دون سمية واضحة. على الفور رد فعل بعد 3 دقائق فوق ، ونحن قادرون على كشف العلامات قوية من الناتج المحلي الإجمالي FucAl الأجنة المعالجة (الشكل رقم 2 ، لوحات اليسار). تم الكشف فقط مضان الخلفية لمراقبة الأجنة microinjected مع الناتج المحلي الإجمالي فوكوز (الشكل 2 ، لوحات اليمين).
الشكل 1. استراتيجية التوسيم glycans fucosylated في طبقة التغليف الأجنة الزرد.
الشكل 2. المجراة في التصوير من خلال مرحلة التطور الجنيني glycans fucosylated الزرد عبر BTTES النحاس (I) المحفزة الكيمياء فوق. هي واحدة microinjected خلايا الأجنة الزرد المرحلة بجرعة واحدة من إجمالي الناتج المحلي ، وسمح لFucAl جمعةالمرجع إلى 9.5 HPF. وكان رد فعل ثم الأجنة مع فلور اليكسا آزيد - 488 يحفزه BTTES النحاس (I). وكان رد فعل تصوير أجنة باستخدام المجهر مبائر. أقصى كثافة ض الإسقاط صور فلور اليكسا 488 مضان (اللوحة العليا) ؛ حقل برايت (اللوحة السفلى). شريط الحجم : 100 ميكرومتر.
المشاكل
| مشكلة | سبب | علاج |
| الأجنة تبدو غير صحية | الحل microinjected تحتوي على ملوثات | وينبغي على نقاء السكريات النوكليوتيدات تكون أكبر من 85 ٪. التحقق من المصدر. |
| لا يوجد أي رد فعل بعد وسم | تركيز النحاس هو أقل من 30 ميكرومتر | يجب الحرص على عدم تمييع الحل من خلال إضافة رد الفعل الزائد المتوسطة E3 الجنين عند إضافة الأجنة ، كما ينخفض معدل التفاعل بشكل كبير عند تركيز النحاس هو أقل من 30 ميكرومتر. |
| الأجنة تموت بعد رد الفعل | سوء التعامل مع الأجنة | تأكد من الماصة نار مصقول وغير مصقول وعاء التفاعل مع طبقة رقيقة جدا من agarose 0.5 ٪. |
| وتبدو الصور متقطعا | ليست الكواشف مختلطة بشكل صحيح قبل إضافة الأجنة | اتبع النظام الموصى بها من أجل إضافة الكواشف ، وتأكد من أنه قد تم الكواشف الكيمياء فوق مختلطة بشكل صحيح قبل ان يضيف الأجنة. |
| وتظهر الصور معطوبة الأجنة | قوية تهز الأضرار الأجنة أثناء عملية التفاعل | يهز بلطف لمدة تقل عن 10 ثوان بمجرد أن الأجنة في الحل. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة (GM093282 لPW ؛ 3U54AI057158 - 06S1 إلى RDS) وصناديق بدء التشغيل من كلية ألبرت اينشتاين للطب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165 | |
| Alexa Fluor 488 azide | Invitrogen | A10266 | |
| dextran, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | D-22913 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Bathocuproinedisulfonic acid | Acros Organics | 164060010 | |
| Glass bottom microwell dish | MatTek Corp. | P35G-1.5-14-C |
References
- Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R.
- Baskin, J. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal click chemistry: Covalent labeling in living systems. Qsar Comb. Sci. 26, 1211-1219 (2007).
- Soriano del Amo, D. Biocompatible copper(I) catalysts for in vivo imaging of glycans. J. Am. Chem. Soc. 132, 16893-16899 (2010).
- Chang, P. V. Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 4030-4033 (2009).
- Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
- Baskin, J. M., Dehnert, K. W., Laughlin, S. T., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. Visualizing enveloping layer glycans during zebrafish early embryogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 10360-10365 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J. Vis. Exp. , (2009).
- Wang, W. Chemoenzymatic synthesis of GDP-L-fucose and the Lewis X glycan derivatives. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 16096-16101 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. , (2009).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th Edition, University of Oregon Press. Eugene. (2007).
- Kimmel, C. B., Warga, R. M., Schilling, T. F. Origin and organization of the zebrafish fate map. Development. 108, 581-594 (1990).
