在斑马鱼胚胎的代谢标记和Bioorthogonal点击化学成像聚糖

Summary

点击化学的方法，允许炔标签聚糖在斑马鱼胚胎的快速，非侵入性和强大的标签描述。在这项研究中，已故的原肠胚形成阶段，在斑马鱼胚胎的包围层Fucosylated聚糖成像。

Abstract

活体成像聚糖最近已经启用了一个bioorthogonal化学记者战略治疗叠氮或炔标记的单糖^1，2细胞或生物体。修改后的单糖，聚糖的生物合成机制处理，纳入细胞表面的糖复合物。 bioorthogonal叠氮或炔标签用于可视化的荧光探针，然后让共价键共轭，或用浓缩和glycoproteomic分析的亲和力探头。这个协议描述fucosylated聚糖在斑马鱼胚胎的无创成像通常使用的，包括程序：1）单细胞阶段的胚胎显微注射与国内生产总值5 alkynylfucose（国内生产总值FucAl），2）标签包围层fucosylated聚糖通过生物 ​​相容性铜（I）催化叠氮炔环加成反应（CuAAC），并通过共聚焦显微镜³ 3）成像叠氮共轭荧光团的斑马鱼胚胎。这里描述的方法可以很容易地扩展到其他类别的聚糖，如含有唾液酸⁴ 和 N -乙酰^5，6的糖链，在发展中国家斑马鱼和其他生物可视化。

Protocol

1。蛋的收集和Dechorionation

1. 收集和斑马鱼的卵转移到35mm培养皿中，删除尽可能多的水，然后添加1毫克/毫升Pronease在E3胚胎培养基E（5 mM氯化钠，0.17 mM的氯化钾，0.33毫米氯化钙₂ · 2H _{2 O，0.33}毫米硫酸镁_4，PH = 7.4），绒毛膜消化。
2. 3-5分钟后，合并到一个烧杯中弥漫着鱼水（60毫克的“即时海洋”每_公升蒸馏水H 2 O）的菜，轻轻的鸡蛋转移到烧杯中，并允许鸡蛋到入水“落“。
3. 鱼水三次冲洗的鸡蛋。从他们的绒毛膜大部分的鸡蛋会被释放。
4. 使用火抛光的玻璃巴斯德吸管，转让dechorionated鸡蛋琼脂糖涂层的培养皿菜肴充满E3胚胎中期。

2。显微注射与国内生产总值FucAl

1. 以下报道的^协议 7，准备注射菜。
2. 转移到充满E3胚胎中期注射菜dechorionated鸡蛋。
3. 准备针，2μL注射液和负载。该解决方案包含了20毫米的国内生产总值FucAl合成chemoenzymatically ⁸任的Alexa Fluor 594 -葡聚糖（5％W / V）作为示踪或酚红样染料（0.1％W / V）在0.2 mol氯化钾。作为阴性对照，与GDP -岩藻糖注射液取代国内生产总值FucAl。
4. 打破了针，调整喷油压力和持续时间，产生了1 NL下降^9。
5. 注入1 NL的任何一个解决方案的鸡蛋。
6. 转移到琼脂糖涂层培养皿充满E3胚胎中期的菜蛋。
7. 在28 ° C孵育的鸡蛋和未受精的卵受精后三到四个小时内删除。

3。 BTTES - 铜（I）催化点击化学反应

1. 当胚胎达到理想的发育阶段（如已故的原肠胚，组织分割和早期幼虫），外套一个96孔板，用琼脂糖基地。
2. ，每孔加入92μLE3胚胎中期，随后另外4μL的Alexa Fluor 488叠氮（从一个2.5毫米的股票_，在H 2 _{O），2μLBTTES，}硫酸铜4 6:1复杂，和轻轻摇动混合。
3. 点击化学试剂使用火抛光的玻璃巴斯德吸管转移到胚胎。每口井应包含少于五个胚胎。
4. 添加2.5μL新鲜配制的抗坏血酸钠（100毫米股票在H ₂ O）发起的点击^反应 3 。终浓度为每一个试剂的Alexa Fluor 488叠氮：100微米; _硫酸铜 4：50微米; BTTES：300微米;抗坏血酸钠：2.5毫米。
5. 3分钟后，加入2微升bathocuproine磺酸（H _{2 O} 50毫米股票），生物相容性铜螯合剂，然后立即稀释100μLE3胚胎中期淬火反应。
6. 胚胎玻璃培养皿和清洗处理的胚胎与15毫升的E3胚胎中期的2倍。

4。成像

1. MatTek玻璃底部的微孔盘上放置一个超低熔点琼脂糖（E3胚胎中期的1.2％（W ​​/ V））的下降，胚胎放入琼脂糖下降。
2. 位置的胚胎背侧或外侧，并置于冰上5分钟，以巩固琼脂糖下降的菜。 E3胚胎培养基添加轻轻的菜，直到它涵盖了琼脂糖下降。
3. 顺序使用共聚焦显微镜，荧光和明亮的现场图像采集。所有胚胎图像采集使用一个5微米的一步区间。综合数字准备使用ImageJ软件。

5。代表性的成果

图1显示了我们两个步骤的标签战略的工作流程。图2显示了斑马鱼的胚胎在受精后9.5小时（HPF）通过BTTES介导CuAAC标签。 BTTES是一个三（triazolylmethyl）胺为基础的配体。它加速CuAAC显着时在原位生成铜（一）协调，促进在生物系统中的环加成反应迅速没有明显的毒性。紧接着一个3分钟的点击反应，我们能够探测到强大的国内生产总值FucAl处理的胚胎标签（图2，左侧面板）。只有背景荧光检测控制胚胎显微注射与GDP -岩藻糖（图2中，右图）。

图1标签fucosylated聚糖在斑马鱼胚胎的包围层的战略。

图2。fucosylated聚糖通过BTTES铜（I）催化点击化学斑马鱼胚胎发育期间体内成像。单细胞阶段斑马鱼的胚胎显微注射单剂量的国内生产总值FucAl并允许发育运到9.5 HPF。胚胎的Alexa Fluor 488叠氮BTTES铜（一）催化反应。使用共聚焦显微镜成像反应胚胎。最大强度Z -投影图像的Alexa Fluor 488荧光（上图）;明场（下图）。比例尺：100微米。

故障排除

问题	原因	补救
看不健康的胚胎	显微注射的溶液中含有污染物	核苷酸糖的纯度应大于85％。检查你的源代码。
没有标签后的反应	铜浓度低于30微米	要小心，不要稀释反应液加​​入过量E3胚胎培养基加入胚胎时，反应率显着下降，当铜浓度低于30微米的。
胚胎死亡后的反应	胚胎处理不当	确保吸管火抛光和反应容器涂一层非常薄的0.5％琼脂糖。
图像看起来参差不齐	所用试剂不正确混合后再加入胚胎	按照建议的顺序添加试剂，并确保点击化学试剂已正确之前加入胚胎混合。
图像显示，胚胎受损	剧烈摇晃的​​胚胎损害的反应过程中	一旦胚胎是在溶液中轻轻摇动少于10秒。

Discussion

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Copper(II) sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich	203165
Alexa Fluor 488 azide	Invitrogen	A10266
dextran, Alexa Fluor 594	Invitrogen	D-22913
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
Bathocuproinedisulfonic acid	Acros Organics	164060010
Glass bottom microwell dish	MatTek Corp.	P35G-1.5-14-C