Summary
Nos ilustran no quirúrgico de entrega de materiales de prueba en los pulmones de ratones anestesiados a través de la tráquea. Este método permite la exposición del pulmón a los patógenos bacterianos y virales, las citocinas, los anticuerpos, los granos, productos químicos, ni colorantes. Nos describen con más detalle la recolección y procesamiento de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón (LDLNs) por citometría de flujo.
Abstract
Fagocitos como los macrófagos alveolares y las células dendríticas del pulmón (PMA) de forma continua muestra los antígenos de los espacios alveolares de los pulmones. Los países menos adelantados, en particular, se sabe que migran a los ganglios linfáticos pulmonares drenan (LDLNs) donde presentan antígenos inhalados a las células T de iniciar una respuesta inmune apropiada a una variedad de inmunógenos 1,2. A las interacciones del modelo entre los pulmones y los antígenos en el aire en los ratones, los antígenos se puede administrar por vía intranasal 1,3,4, intratraqueal 5 o 6 en forma de aerosoles. La entrega por cada ruta incluye distintas habilidades técnicas y las limitaciones que deben tenerse en cuenta antes de diseñar un experimento. Por ejemplo, la exposición intranasal en aerosol y ofrece tanto a los antígenos de los pulmones y el tracto respiratorio superior. Por lo tanto, los antígenos pueden acceder a la nasal de tejido linfoide asociado (NALT) 7, lo que podría complicar la interpretación de los resultados. Además, la deglución, el estornudo y la tasa de respiración del ratón también puede dar lugar a incoherencias en las dosis administradas. Aunque el compromiso del tracto respiratorio superior puede ser preferible para algunos estudios, puede complicar los experimentos se centra en los eventos específicamente iniciado en los pulmones. En este contexto, la intratraqueal (IT) es preferible, ya que proporciona los materiales de prueba directamente en los pulmones y pasa por el NALT. Muchos protocolos de inyección incluyen la intubación o ciegos de la tráquea a través de la cavidad oral o la exposición quirúrgica de la tráquea para acceder a los pulmones. En este documento, se describe un simple y consistente, método no quirúrgico para la instilación. La apertura de la tráquea se visualizan mediante un laringoscopio y una aguja doblada sonda se inserta directamente en la tráquea para entregar el inóculo. También se describen los procedimientos para la recolección y procesamiento de LDLNs y los pulmones para el análisis del tráfico de antígeno por citometría de flujo.
Protocol
1. Antes del proceso, preparar y reunir los siguientes
- Por favor refiérase a la imagen de la Figura 1a) y 1b) para la construcción de una plataforma de madera para contener el ratón durante el procedimiento.
- Digestión de la mezcla de los ganglios linfáticos - HBSS + 1.25mg/ml colagenasa TypeIV o 2,5 mg / ml de colagenasa D
- Mezcla de digestión para los pulmones - HBSS + 1 mg / ml de colagenasa
- Diluir las gotas de látex (1:20) en PBS durante la inyección intraperitoneal de visualizar el LDLNs
Nota: LDLNs son pequeños y difíciles de encontrar. Para saber cómo se encuentran, se inyectan 200μl de las 1:20 diluido rojo bolas de látex fluorescentes ip en el ratón. El peritoneo desagües a estos LDLNs 8. 24 hpi, exponer la cavidad torácica del ratón como se describe anteriormente. El LDLNs se ve de color rosa de las cuentas que drena de la cavidad peritoneal.
- Glóbulos rojos (RBC) tampón de lisis - 0,15 M NH 4 Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM EDTA Na 2 en 1 litro dH 2 0. Ajustar el pH a 7,2-7,4 y almacenar a temperatura ambiente.
- Celular 70μm 100μm o colador
- Solución madre de 0,5 M EDTA, pH = 8.0
- HBSS sin CaCl2 y MgCl2
- Tijeras y pinzas de extremos romos
- Laringoscopio
- Aguja de una sonda (calibre 22) se inclinó en un ángulo (Figura 2)
- Espuma de poliestireno bordo y los pernos para la difusión del ratón
- Balance bandeja superior
- Anilina azul Solución - 10mg/ml en H 2 O
Nota: Nosotros vamos a usar esta solución para la demostración de la técnica de inyección de la misma.
2. Preparación y administración de ratón anestesia
- Prepare una mezcla de xilazina y ketamina en PBS estéril a fin de que las concentraciones finales son 2mg/ml y 10mg/ml respectivamente.
- Pesar el ratón sobre una balanza de platillos principales.
- Calcular la dosis necesaria para cada ratón. Dosis a la xilazina (4.2 mg / kg) y ketamina (70-80 mg / kg) de peso corporal con un volumen adecuado de la mezcla preparada y se inyecta intaperitoneally. Cada cepa de ratón puede requerir la optimización de la anestesia. Los ratones que recibieron demasiada anestesia puede tener una tasa de respiración reducida que puede ser fatal después de la inoculación se inculca en los pulmones.
- Después de 3-5 minutos, observe el ratón por los efectos de la anestesia. De verificación de los siguientes signos para confirmar que el ratón está completamente anestesiado:
- El ritmo respiratorio debe reducir la velocidad.
- El ratón no se debe estirar su brazo al recogerlo por el cuello.
- No debe haber ninguna respuesta cuando las extremidades posteriores son estimulados.
Si estos criterios no se cumplen, espere unos minutos y vuelva a revisar antes de proceder al siguiente paso.
3. Inyección intratraqueal
- Preparar el inóculo en solución salina 50μl. Llene una jeringa de 1 ml equipada con una aguja doblada sonda estéril con el inóculo. La jeringa debe estar cargado con una bolsa de aire 100μl detrás del inóculo para asegurar que todo el líquido se inculca en el pulmón.
- Coloque el ratón sobre la plataforma inclinada de madera que cuelga de sus incisivos en el cable y frenar suavemente en su lugar con un pedazo de cinta.
- Encienda el laringoscopio con la mano izquierda (si eres diestro) y tomar un par de fórceps romos terminado. Use la punta del laringoscopio y pinzas de la palanca suavemente a abrir la boca.
- Con las pinzas, tire de la lengua y mantenerla a un lado. Guía de la hoja del laringoscopio hacia la parte posterior de la boca. Mantenga el laringoscopio presionado muy suavemente en un ángulo de 90 º hasta que vea la apertura de la tráquea. Sostenga el laringoscopio en su lugar. Se debe tener cuidado al tirar de la lengua de la boca y esto debe hacerse con cuidado para no daña el tejido se produce.
- Con la otra mano, tome la jeringa de 1 ml que contiene el inóculo, equipado con la sonda de aguja doblada con las manos derecha e inserte la aguja en la tráquea hasta la curva de la aguja por los incisivos delanteros. Empuje el émbolo de manera uniforme para entregar el inóculo. El inóculo no debe tener burbujas. Retire la aguja de la tráquea, tan pronto como sea posible. Los ratones se asfixian y mueren, si se bloquea la tráquea por mucho tiempo. Mantenga el ratón vertical durante unos segundos para permitir inóculo que se inhala en los pulmones.
- Tome el mouse fuera de la plataforma y lo coloque cerca de una lámpara de calentamiento. No deje a los ratones con el calor por largos períodos de tiempo. El ratón debe estar completamente despierto a los 30 minutos después del procedimiento (tiempo de recuperación puede variar en función de las cepas). Los ratones deben ser observados con diligencia durante este tiempo y no se debe permitir que se caliente demasiado o demasiado frío, esto también podría poner a los ratones en dificultad respiratoria que lleva a la muerte.
4. La recolección y el procesamiento de pulmón ganglios linfáticos de drenaje y los pulmones para citometría de flujo
- Sacrificio de ratones utilizando el método deseado según las directrices eutanasia AVMA. Esto puede variar dependiendo de los resultados de la cosecha individual. La administración de una letal de pentobarbital sódico no es un ejemplo de un procedimiento de eutanasia apropiado. No hemos visto los efectos negativos de la eutanasia pulmonar de CO 2.
- Pin de los brazos y las piernas en una tabla de disección. Hacer una incisión a lo largo de la mitad de la cara ventral con unas tijeras. Tire suavemente la piel y exponer los músculos de la pared torácica.
- Hacer incisiones a través de los músculos de la pared torácica para exponer los órganos abdominales.
- Sostenga la punta del esternón, con las pinzas y perforar la membrana. Corte el diafragma a lo largo de los lados de la caja torácica.
- Con las tijeras paralelas a la superficie de la placa de disección, corte a través de la cavidad torácica a lo largo de la línea dorso-ventral en ambos lados.
- Levante ligeramente la caja torácica hacia arriba. En el lado derecho del corazón, justo debajo de la timo, busca dos ganglios linfáticos. Un nodo linfático tercero un poco más grande se encuentra debajo de un pequeño vaso sanguíneo arterial que corre perpendicular a la tráquea. Ganglios linfáticos de la cosecha en 1 ml de la mezcla de digestión de los ganglios linfáticos.
- Después de la cosecha de los ganglios linfáticos, mantenga el corazón con un par de pinzas de agarre y los pulmones con el otro. Los pulmones de la cosecha en 3 ml de PBS enfriado con hielo en una placa de 6 pocillos.
- Separar los lóbulos de los pulmones, aspirar el PBS y cortar los lóbulos en pequeños trozos con pinzas y tijeras. Añadir 3 ml de la mezcla de la digestión de los pulmones. Guarde la placa de 6 pocillos en el hielo durante esta etapa.
- Incubar los ganglios linfáticos de 25-30 minutos y los pulmones durante 30 minutos a 37 ° C. Añadir EDTA a una concentración final de 10 mm a cada una de las mezclas de digestión para detener la reacción y el lugar en el hielo.
- Con una jeringa de 3 ml, pasar pedazos de pulmones a través de una aguja 18GA 3 veces. Mash las piezas de los pulmones y la LN a través de filtros de células 70-100μm con la parte de atrás de un émbolo de la jeringa de 1 ml. Lavado de los filtros de células con 10 ml de HBSS sin Ca 2 + y Mg 2 +. Centrifugar a 500 xg durante 5 min.
- Resuspender el precipitado en 5 ml de tampón de lisis y se incuba durante 3 min a temperatura ambiente. Añadir 10 ml de HBSS sin Ca 2 + y Mg 2 + para saciar lisis. Centrifugar a 500 xg durante 5 min. Educar a los pulmones y las suspensiones de células individuales LDLN a 10 ml y 5 ml, respectivamente. Contador de células vivas usando un hemocitómetro por exclusión de azul tripan. Las células ya están listos para teñir de citometría de flujo. Un lóbulo del pulmón podría ser suficiente para citometría de flujo. Otros lóbulos se puede utilizar para otras preguntas experimentales en el ratón es el mismo, tales como los homogeneizados de citoquinas o de tejidos para histología.
5. Los resultados representativos:
Los países menos adelantados y los macrófagos alveolares de los pulmones adquieren antígeno de los espacios alveolares de los pulmones inmediatamente después de la inyección. La Figura 3 muestra el porcentaje de CD11c + (expresado en los países menos adelantados y los macrófagos alveolares), las células que son positivas para la etiqueta fluorescente esporas de Bacillus anthracis, 30 minutos después de que la inyección. En este momento, ~ 15,9% de CD45 + CD11c + células en la suspensión de pulmón de células individuales albergaba esporas de Bacillus anthracis (Figura 3, paneles inferiores). Para una mayor caracterización de células CD11c + en los pulmones, se refieren a Kim y Braciale 4. Cuentas de marcado con fluorescencia se utilizan habitualmente para evaluar el tráfico de los antígenos de partículas de LDLNs 9. Para evaluar este medio de transporte desde los pulmones hasta LDLNs, fluorescentes bolas de látex estaban inyectados con LPS y LDLNs fueron analizados a las 24 hpi. Cerca del 4% de células CD11c alta en el LDLNs albergaba perlas fluorescentes en 24hpi (Figura 4). Estos experimentos muestran que el representante de este protocolo puede ser utilizado eficientemente para rastrear las células que adquieren antígenos inhalados de partículas en los pulmones y posteriormente el tráfico a la LDLNs.
Figura 1. Plataforma de madera para sujetar a los ratones durante la inyección. Un bloque de madera fue cortada en un ángulo y barras de metal fueron ajustados, frente a ver la figura 1a) y 1b lado ver la figura). Un pequeño trozo de alambre se enrolla alrededor de la barra de metal para anclar la incisivos frente a la del ratón. Un pedazo de la cinta se sujeta a la plataforma para atar alrededor del ratón para mantenerla en su lugar durante el procedimiento.
Figura 2. Aguja por sonda nasogástrica para la inyección. Una aguja de sonda (derecha) fue doblado en un ángulo de ~ 135 ° (izquierda) para que la inyección.
Figura 3. Porcentaje de todas las células CD11c + en los pulmones que el puerto se inyecta expresando GFP Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), después del desafío 5h. AJ ratones fueron desafío con 1x10 8 esporas de Bacillus anthracis-GFP y los pulmones se analizaron después de la infección en 5h. Los gráficos de puntos muestra el porcentaje de CD11c + células de los pulmones que son positivas para Bacillus anthracis.
Figura 4. La detección de perlas fluorescentes (amarillo / verde) en el pulmón ganglios linfáticos de drenaje 24 horas después de i. Inyección de t. AJ ratones se les administró PBS (izquierda) o 5x10 9 Fluoresbrite YG microesferas (0.5μm) con 10μg LPS (panel derecho) que se analizaron y LDLNs 24hpi. Representante de gráficos de puntos muestra el porcentaje de células CD11c alta en el LDLNs que las cuentas del puerto fluorescentes conspiraron contra un canal vacío.
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Discussion
Hemos utilizado este protocolo para estudiar el tráfico de esporas de Bacillus anthracis de los pulmones a la LDLNs. Para aplicaciones similares, el número de partículas llega a los pulmones deben ser elegidos cuidadosamente para que el material inyectado puede ser detectado en el LDLNs por citometría de flujo. También se ha utilizado con éxito este método para la transferencia adoptiva de células y el etiquetado de poblaciones específicas de pulmón de células con anticuerpos marcados con fluorescencia. Además, este método se utiliza habitualmente para administrar bleomicina (un inductor químico de la fibrosis pulmonar) y las citocinas directamente en los 10 pulmones.
Aunque este método permite la entrega constante de materiales de prueba en los pulmones, se requiere una amplia formación y validación (que se logra por medio de contraste en inculcar a los pulmones). Este método no puede tener la misma relevancia fisiológica como otras rutas de la inhalación, ya que excluye las vías respiratorias superiores, donde las interacciones y la respuesta inmune puede ser iniciado. Sin embargo, es preferible que la interpretación puede ser complicada debido a la absorción del fármaco administrado por los ganglios linfáticos regionales en la cabeza y el cuello y por la estimulación del epitelio del tracto respiratorio. Al igual que con todos los modelos, los factores experimentales tales como la dosis, vehículo para la entrega, la distribución del material inyectado, el daño al epitelio respiratorio, y efectos de la anestesia todos deben ser considerados al diseñar experimentos. En comparación con los procedimientos convencionales para la instilación, creemos que este método reduce significativamente el daño al epitelio del tracto respiratorio. Sin embargo, grupos de control apropiados deben ser utilizados para explicar las lesiones ya que el daño en el sitio de la inoculación podría afectar el suministro de los antígenos a los ganglios linfáticos 11. Recomendamos el uso de solución salina como vehículo, pero si el material de ensayo requiere de medios específicos para la eficacia, los controles del vehículo no debe ser descuidado. Distribución del material particulado se inyecta en los diferentes lóbulos de los pulmones puede ser un parámetro importante para ciertos experimentos. En estos casos, cada uno de los lóbulos se pueden analizar por separado inmediatamente después de que la inyección. La distribución de los materiales en los diferentes lóbulos de los pulmones después de que la ruta de la instilación ha sido descrito por Costa et al 12.
Nos centramos nuestro análisis en los ganglios linfáticos de drenaje se ha descrito anteriormente que se puede acceder en forma más salvaje y eliminar las cepas de ratones utilizados en nuestros laboratorios. Sin embargo, hay otros ganglios linfáticos de drenaje en la región torácica 13,14 que también puede ser analizado. Si más ganglios linfáticos son deseables para un experimento, se recomienda la identificación inicial con la inyección ip de perlas fluorescentes como se describe en el protocolo. Dos de los ganglios linfáticos que se recomienda para el análisis se encuentran en las proximidades de la timo por lo tanto, se debe tener cuidado durante la extracción.
Como se mencionó anteriormente, este método puede ser adaptado para exponer los pulmones a una variedad de organismos infecciosos, alergenos o toxinas. Se proporciona una alternativa simple y consistente para las vías convencionales de la exposición por inhalación y excluye las vías respiratorias superiores. Es particularmente útil para los experimentos que se centran en eventos que se inician en los pulmones y el pulmón ganglios linfáticos de drenaje antes de cualquier otro sitio.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell stariner | BD Biosciences | ||
| Aniline Blue | Fisher Scientific | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington Biochemical | ||
| Collagenase D | Roche Group | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc. | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc. | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | Welch Allyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd, Inc. |
References
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