Wir illustrieren nicht-chirurgische Lieferung von Testmaterialien in den Lungen von narkotisierten Mäusen über die Luftröhre. Dieses Verfahren ermöglicht die Lunge Exposition gegenüber bakteriellen und viralen Erregern, Zytokine, Antikörper, Perlen, Chemikalien oder Farbstoffe. Wir beschreiben ferner die Ernte und Verarbeitung der Lunge und der Lunge Lymphknoten (LDLNs) für die Durchflusszytometrie.
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Methodenartikel
Nicht-chirurgische Intratrachealbiopersistenztest von Mäusen mit Analyse der Lungen-und Lungenforschung Lymphknoten mittels Durchflusszytometrie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Phagozytierenden Zellen wie Alveolarmakrophagen und Lunge dendritischen Zellen (LDCs) kontinuierlich Probe Antigene aus dem Alveolarräumen in der Lunge. LDCs, insbesondere, sind dafür bekannt, in die Lunge Lymphknoten (LDLNs), wo sie vorhanden inhalative Antigene an T-Zellen zur Einleitung einer entsprechenden Immunantwort auf eine Vielzahl von Immunogenen 1,2. Migrieren Zur Modellierung Wechselwirkungen zwischen den Lungen und in der Luft-Antigene in Mäusen können Antigene intranasal 1,3,4 verabreicht werden, intratracheal 5 oder als Aerosole 6. Lieferung bis jede Route umfasst verschiedene technische Fähigkeiten und Einschränkungen, die vor der Gestaltung eines Experiments berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel liefert intranasale und Aerosol Exposition Antigene sowohl die Lungen und die oberen Atemwege. Daher Antigene können auf die Nase assoziierten lymphatischen Gewebe (NALT) 7, möglicherweise erschweren die Interpretation der Ergebnisse. Darüber hinaus können beim Schlucken, Niesen und die Atemfrequenz der Maus auch zu Inkonsistenzen in den Dosen geliefert führen. Obwohl die Beteiligung der oberen Atemwege bei einigen Studien bevorzugt werden, kann es die Experimente mit Schwerpunkt auf Veranstaltungen speziell in der Lunge ausgelöst. In dieser Einstellung wird die intratracheale (it) Route vorzuziehen, da sie Testmaterialien liefert direkt in die Lunge und umgeht die NALT. Viele es Injektion Protokolle beinhalten entweder blind Intubation der Luftröhre durch die Mundhöhle oder chirurgische Freilegung der Luftröhre in die Lunge zugreifen. Hier beschreiben wir eine einfache, konsistente, nicht-chirurgische Methode für die es Instillation. Die Öffnung der Luftröhre wird visualisiert mit einem Laryngoskop und eine gebogene Nadel Sonde wird dann direkt in die Luftröhre eingeführt, um die Inokulum zu liefern. Wir beschreiben auch Verfahren für die Ernte und Verarbeitung von LDLNs und Lunge für die Analyse von Antigen Handel mittels Durchflusszytometrie.
Protokoll
1. Bevor der Prozess vorbereiten und sammeln Sie die folgenden Elemente
- Bitte beachten Sie das Bild in Abbildung 1a) und 1b) für den Bau einer hölzernen Plattform, um die Maus während des Verfahrens zu beschränken.
- Verdauung Mix für Lymphknoten - HBSS + 1.25mg/ml Collagenase TypIV oder 2,5 mg / ml Collagenase D
- Verdauung Mix für Lungen - HBSS + 1 mg / ml Collagenase
- Verdünnen Latexkügelchen (1:20) in PBS für intraperitoneale Injektion der LDLNs visualisieren
Hinweis: LDLNs sind klein und schwer zu finden. Um zu erfahren, wie Sie sie finden, injizieren 200 ul der 1:20 verdünnt....
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Diskussion
Wir haben dieses Protokoll genutzt werden, um den Handel mit Bacillus anthracis Sporen aus der Lunge zu den LDLNs studieren. Für ähnliche Anwendungen, sollte die Anzahl der Partikel, die die Lunge sorgfältig ausgewählt werden, so dass das eingespritzte Material in der LDLNs kann mittels Durchflusszytometrie detektiert werden. Wir haben auch erfolgreich diese Methode für adoptiven Transfer von Zellen und die Kennzeichnung von bestimmten Lungen-Zell-Populationen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern eingesetzt. D.......
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| 70μm Zelle stariner | BD | ||
| Anilinblau | Fischer | A967-25 | |
| Tierfütterung Nadel | Popper and Sons Inc | 7920 | |
| Collagenase | Sigma | C2139 | |
| Collagenase TypIV | Worthington | ||
| Collagenase D | Roche | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0,5 um) | Polysciences, Inc | 17152 | |
| HBSS ohne Calciumchlorid und Magnesiumchlorid | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamin HCl (100mg/ml) | Hospira Inc | ||
| Laryngoskopspatel | PennCentury, Inc | Für Modell LS-1 | Siehe www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optik Laryngoskop | WelchAllyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Perlen (0,5 um) | Invitrogen | F8812 | Für ip-Injektion |
| Xylazin (100mg/ml) | Lloyd Laboratories |
Referenzen
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Imm....
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Nachdrucke und Genehmigungen
