Summary
Wir illustrieren nicht-chirurgische Lieferung von Testmaterialien in den Lungen von narkotisierten Mäusen über die Luftröhre. Dieses Verfahren ermöglicht die Lunge Exposition gegenüber bakteriellen und viralen Erregern, Zytokine, Antikörper, Perlen, Chemikalien oder Farbstoffe. Wir beschreiben ferner die Ernte und Verarbeitung der Lunge und der Lunge Lymphknoten (LDLNs) für die Durchflusszytometrie.
Abstract
Phagozytierenden Zellen wie Alveolarmakrophagen und Lunge dendritischen Zellen (LDCs) kontinuierlich Probe Antigene aus dem Alveolarräumen in der Lunge. LDCs, insbesondere, sind dafür bekannt, in die Lunge Lymphknoten (LDLNs), wo sie vorhanden inhalative Antigene an T-Zellen zur Einleitung einer entsprechenden Immunantwort auf eine Vielzahl von Immunogenen 1,2. Migrieren Zur Modellierung Wechselwirkungen zwischen den Lungen und in der Luft-Antigene in Mäusen können Antigene intranasal 1,3,4 verabreicht werden, intratracheal 5 oder als Aerosole 6. Lieferung bis jede Route umfasst verschiedene technische Fähigkeiten und Einschränkungen, die vor der Gestaltung eines Experiments berücksichtigt werden müssen. Zum Beispiel liefert intranasale und Aerosol Exposition Antigene sowohl die Lungen und die oberen Atemwege. Daher Antigene können auf die Nase assoziierten lymphatischen Gewebe (NALT) 7, möglicherweise erschweren die Interpretation der Ergebnisse. Darüber hinaus können beim Schlucken, Niesen und die Atemfrequenz der Maus auch zu Inkonsistenzen in den Dosen geliefert führen. Obwohl die Beteiligung der oberen Atemwege bei einigen Studien bevorzugt werden, kann es die Experimente mit Schwerpunkt auf Veranstaltungen speziell in der Lunge ausgelöst. In dieser Einstellung wird die intratracheale (it) Route vorzuziehen, da sie Testmaterialien liefert direkt in die Lunge und umgeht die NALT. Viele es Injektion Protokolle beinhalten entweder blind Intubation der Luftröhre durch die Mundhöhle oder chirurgische Freilegung der Luftröhre in die Lunge zugreifen. Hier beschreiben wir eine einfache, konsistente, nicht-chirurgische Methode für die es Instillation. Die Öffnung der Luftröhre wird visualisiert mit einem Laryngoskop und eine gebogene Nadel Sonde wird dann direkt in die Luftröhre eingeführt, um die Inokulum zu liefern. Wir beschreiben auch Verfahren für die Ernte und Verarbeitung von LDLNs und Lunge für die Analyse von Antigen Handel mittels Durchflusszytometrie.
Protocol
1. Bevor der Prozess vorbereiten und sammeln Sie die folgenden Elemente
- Bitte beachten Sie das Bild in Abbildung 1a) und 1b) für den Bau einer hölzernen Plattform, um die Maus während des Verfahrens zu beschränken.
- Verdauung Mix für Lymphknoten - HBSS + 1.25mg/ml Collagenase TypIV oder 2,5 mg / ml Collagenase D
- Verdauung Mix für Lungen - HBSS + 1 mg / ml Collagenase
- Verdünnen Latexkügelchen (1:20) in PBS für intraperitoneale Injektion der LDLNs visualisieren
Hinweis: LDLNs sind klein und schwer zu finden. Um zu erfahren, wie Sie sie finden, injizieren 200 ul der 1:20 verdünnt rot fluoreszierende Latexkügelchen ip in der Maus. Das Bauchfell Kanalisation, diese LDLNs 8. 24 hpi, setzen die Brusthöhle von der Maus wie oben beschrieben. Die LDLNs wird erscheint rosa von den Perlen, die aus der Bauchhöhle abgeleitet.
- Red Blood Cell (RBC) Lysis Buffer - 0,15 NH 4 Cl, 10 mM KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA in 1L dH 2 0. Der pH-Wert auf 7,2-7,4 und bei Raumtemperatur lagern.
- 70μm oder 100 um Zellsieb
- Stammlösung von 0,5 M EDTA, pH = 8,0
- HBSS ohne CaCl 2 und MgCl 2
- Scheren und stumpfem Ende Zange
- Laryngoskop
- Gavage Nadel (22 Gauge) abgewinkelt (Abb. 2)
- Styropor Kost und Stifte für die Verbreitung der Maus
- Top Waage
- Anilinblau Solution - 10mg/ml in H 2 O
Hinweis: Wir werden mit dieser Lösung für die Demonstration der es Injektionstechnik.
2. Herstellung und Anwendung von Maus-Narkose
- Bereiten Sie eine Mischung aus Xylazin und Ketamin in sterile PBS, so dass die Endkonzentrationen 2mg/ml und 10mg/ml sind jeweils.
- Wiegen Sie die Maus auf eine Top-Waage.
- Berechnen Sie die Dosis für jede Maus erforderlich. Dosis am Xylazin (2-4 mg / kg) und Ketamin (70-80 mg / kg) Körpergewicht durch geeignete Volumen der hergestellten Mischung und injizieren intaperitoneally. Jede Maus-Stamm kann verlangen, Optimierung der Narkose. Mäuse, die zu viel Narkosemittel kann eine verminderte Atemfrequenz, die tödlich sein könnte, nachdem Inokulum in die Lunge instilliert wird.
- Nach 3-5 Minuten, beachten Sie die Maus um die Effekte aus der Narkose. Überprüfen Sie die folgenden Zeichen, um zu bestätigen, dass die Maus vollständig betäubt ist:
- Die Atemfrequenz verlangsamen sollte.
- Die Maus sollte nicht strecken den Arm, wenn sie durch den Hals griff.
- Es sollte keine Reaktion, wenn die Hinterbeine stimuliert werden.
Sind diese Kriterien nicht erfüllt sind, für ein paar Minuten warten und erneut prüfen, bevor Sie den nächsten Schritt.
3. Intratracheale Injektion
- Bereiten Sie das Inokulum in 50 ul Kochsalzlösung. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit einer sterilen Nadel verbogen Magensonde mit dem Inokulum ausgestattet. Die Spritze sollte mit einer 100 &mgr; Luftpolster hinter dem Inokulum geladen werden, um sicherzustellen, dass alle von der Flüssigkeit in der Lunge ist anerzogen.
- Platzieren Sie die Maus auf den abgewinkelten Holzplattform hängen von seinen Schneidezähnen auf dem Draht und sanft zurückhalten Sie ihn mit einem Stück Band.
- Schalten Sie das Laryngoskop mit der linken Hand (wenn Sie Rechtshänder sind) und greifen ein Paar stumpfe Ende einer Pinzette. Verwenden Sie die Spitze des Laryngoskop und die Zange zu hebeln öffnen Sie den Mund.
- Mit der Zange, ziehen Sie die Zunge heraus und halten Sie sie zur Seite. Führen Sie die Laryngoskopspatel in Richtung der Rückseite des Mundes. Halten Sie das Laryngoskop nach unten sehr vorsichtig in einem 90 ° Winkel gedrückt, bis Sie die Öffnung der Luftröhre zu sehen. Halten Sie das Laryngoskop in Kraft. Vorsicht beim Ziehen der Zunge aus dem Mund, und dies sollte vorsichtig erfolgen, damit keine Gewebeschäden auftritt.
- Mit der anderen Hand nehmen Sie die 1 ml Spritze mit dem Inokulum, mit dem gebogenen Sonde Nadel mit der rechten Hand montiert und die Nadel in die Luftröhre bis zur Biegung der Nadel wird durch den vorderen Schneidezähnen. Drücken Sie den Kolben gleichmäßig auf die Inokulum zu liefern. Das Inokulum sollte nicht Blase. Ziehen Sie die Nadel aus der Luftröhre so schnell wie möglich. Mäuse ersticken und sterben, wenn die Luftröhre zu lange blockiert wird. Halten Sie die Maustaste aufrecht für ein paar Sekunden, bis Inokulum in die Lunge eingeatmet werden.
- Nehmen Sie die Maus aus der Plattform und stellen Sie es in der Nähe einer Wärmelampe. Lassen Sie keine Mäuse unter direkter Hitze für längere Zeit. Die Maus sollte hellwach innerhalb von 30 min nach dem Eingriff (Recovery-Zeit kann auf der Grundlage Stämme variieren). Mäuse fleißig sollte während dieser Zeit beobachtet werden und darf nicht zu heiß oder zu kalt werden, könnte dies auch stellen die Mäuse in Atemnot zum Tod führen.
4. Ernte und Verarbeitung Lung Lymphknoten und die Lunge für die Durchflusszytometrie
- Sacrifice Mäusen mit der gewünschten Methode sollte nach dem AVMA Euthanasie-Richtlinien. Dies kann je nach individuellen Ernte Ergebnisse. Die Verabreichung einer tödlichen hat der Natrium-Pentobarbital ist ein Beispiel für ein geeignetes Verfahren Euthanasie. Wir haben keine negativen Effekte in der Lunge der Euthanasie von CO 2 zu sehen.
- Pin den Armen und Beinen auf einer Dissektion Bord. Machen Sie einen Schnitt entlang der Mitte der Bauchseite mit einer Schere. Ziehen Sie die Haut und setzen die Brustwand Muskeln.
- Machen Sie Schnitte durch die Brustwand Muskeln, um die Bauchorgane aussetzen.
- Halten Sie die Spitze des Brustbeins mit der Zange und Punktion der Membran. Schneiden Sie die Membran an den Seiten des Brustkorbs.
- Mit der Schere parallel zur Dissektion Plattenoberfläche durch die Brusthöhle entlang der dorso-ventralen Linie auf beiden Seiten abgeschnitten.
- Heben Sie den Brustkorb auf. Auf der rechten Seite des Herzens, etwas unterhalb des Thymus, für zwei Lymphknoten zu suchen. Ein etwas größeres dritten Lymphknoten unter einer kleinen arteriellen Blutgefäße, die senkrecht zu der Luftröhre entfernt. Ernte Lymphknoten in 1 ml der Lymphknoten Verdauung zu mischen.
- Nach der Ernte der Lymphknoten, halten das Herz mit einer Pinzette und greifen die Lungen mit einem anderen. Ernte Lungen in 3 ml eiskaltem PBS in einer 6-Well-Platte.
- Trennen Sie die Lappen der Lunge, absaugen PBS und hacken die Lappen in kleine Stücke mit einer Pinzette und Schere. Add 3ml der Verdauung Mix für Lungen. Halten Sie die 6-Well-Platte auf Eis bei diesem Schritt.
- Inkubieren Sie die Lymphknoten für 25-30 min und Lunge für 30 min bei 37 ° C. Add EDTA zu einer Endkonzentration von 10mM zu jedem der Verdauung Mischungen, die Reaktion und auf Eis zu stoppen.
- Mit einer 3 ml Spritze, pass Stücke von Lunge durch eine 18GA Nadel 3 mal. Mash die Stücke der Lunge und der LNS durch 70-100 um Zelle Siebe mit dem hinteren Ende eines 1ml Spritzenkolben. Waschen Sie die Zelle Siebe mit 10 ml HBSS ohne Ca 2 + und Mg 2 +. Zentrifuge bei 500 xg für 5 min.
- Das Pellet in 5 ml RBC Lysispuffer und Inkubation für 3 min bei Raumtemperatur. Fügen Sie 10 ml HBSS ohne Ca 2 + und Mg 2 + zur Lyse zu stillen. Zentrifuge bei 500 xg für 5 min. Rufen Sie die Lunge und LDLN einzelnen Zellsuspensionen bis 10 ml und 5 ml bzw.. Graf lebenden Zellen mit Hilfe eines Hämazytometer durch Trypanblau-Ausschluss. Die Zellen sind nun bereit, für die Durchflusszytometrie Fleck. 1 Lappen der Lunge ausreichend sein für die Durchflusszytometrie. Andere Lappen kann auch für andere experimentelle Fragestellungen innerhalb der gleichen Maus wie Homogenaten für Zytokine oder Gewebe für die Histologie verwendet werden.
5. Repräsentative Ergebnisse:
LDCs und Alveolarmakrophagen in der Lunge zu erwerben Antigen aus dem Alveolarräumen der Lunge unmittelbar darauf folgenden Injektion. Abbildung 3 zeigt den Prozentsatz von CD11c + (ausgedrückt auf LDCs und Alveolarmakrophagen) Zellen, die positiv für fluoreszenzmarkierten Bacillus anthracis Sporen, 30 min post es Injektion. Zu diesem Zeitpunkt hegte ~ 15,9% der CD45 + CD11c + Zellen in der Lunge einzigen Zellsuspension Bacillus anthracis Sporen (Abbildung 3, untere Reihe). Zur weiteren Charakterisierung der CD11c + Zellen in der Lunge, um Kim und Braciale 4 beziehen. Fluoreszenzmarkierten Beads werden routinemäßig eingesetzt zur Bekämpfung von partikulären Antigenen an LDLNs 9 zu bewerten. Zur Beurteilung dieser Transport von der Lunge zu LDLNs wurden fluoreszierende Latexkügelchen mit LPS und LDLNs wurden bei 24 hpi analysiert injiziert. Etwa 4% der CD11c hallo Zellen in der LDLNs hegte fluoreszierende Kügelchen in 24hpi (Abbildung 4). Diese repräsentative Experimente zeigen, dass dieses Protokoll effizient genutzt werden kann, um Zellen, die eingeatmet Partikel Antigene zu erwerben in den Lungen und in der Folge Verkehr sie die LDLNs verfolgen.
Abbildung 1. Holzplattform für die Fesselung von Mäusen während es Injektion. Ein Holzblock wurde in einem Winkel geschnitten und Metallstangen wurden eingebaut, Vorderansicht Abbildung 1a) und Seitenansicht Bild 1b). Ein kleines Stück Draht um den Metallstab gewickelt, um die vorderen Schneidezähne der Maus zu verankern. Ein Stück Band wurde auf die Plattform rund um die Maus binden, um ihn zu halten, während des Verfahrens angebracht.
Abbildung 2. Gavage Nadel für ihn Injektion. Eine Magensonde Nadel (rechts) wurde in einem Winkel von ~ 135 ° (links) für ihn Injektion gebogen.
Abbildung 3. Prozentsatz aller CD11c + Zellen in der Lunge, die es injiziert GFP-exprimierenden Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), 5 Stunden post Challenge Hafen. AJ-Mäuse wurden Herausforderung mit 1x10 8 GFP-Bacillus anthracis Sporen und die Lungen wurden in 5 Stunden nach der Infektion analysiert. Die Dot-Plots zeigen Anteil der CD11c + Lungenzellen, die positiv für Bacillus anthracis sind.
Abbildung 4. Detektion von fluoreszierenden Kügelchen (gelb / grün) in der Lunge Lymphknoten 24 Stunden nach der i. T Injektion. AJ-Mäuse wurden entweder mit PBS (linkes Bild) oder 5x10 9 Fluoresbrite YG Microspheres (0,5 um) mit 10 ug LPS (rechts) und es LDLNs analysiert 24hpi gegeben wurden. Vertreter Dot-Plots zeigen Anteil der CD11c hallo Zellen in der LDLNs, dass Hafen fluoreszierende Kügelchen gegen einen leeren Kanal aufgezeichnet.
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Discussion
Wir haben dieses Protokoll genutzt werden, um den Handel mit Bacillus anthracis Sporen aus der Lunge zu den LDLNs studieren. Für ähnliche Anwendungen, sollte die Anzahl der Partikel, die die Lunge sorgfältig ausgewählt werden, so dass das eingespritzte Material in der LDLNs kann mittels Durchflusszytometrie detektiert werden. Wir haben auch erfolgreich diese Methode für adoptiven Transfer von Zellen und die Kennzeichnung von bestimmten Lungen-Zell-Populationen mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern eingesetzt. Darüber hinaus ist diese Methode routinemäßig verwendet, um Bleomycin (ein chemischer Induktor von Lungenfibrose) und Zytokine direkt in die Lungen 10 zu verwalten.
Obwohl diese Methode ermöglicht die konsistente Bereitstellung von Testmaterial in die Lunge, bedarf es umfangreicher Schulungen und Anerkennung (erreicht durch Einträufeln Farbstoff in der Lunge). Diese Methode kann nicht die gleiche physiologische Relevanz als andere Wege der Inhalation, weil es die oberen Atemwege, wo wichtige Wechselwirkungen und Immunreaktionen ausgelöst werden kann ausschließt. Allerdings ist es vorzuziehen, wo Auslegung durch die Aufnahme der verabreichten Mittel kann durch regionale Lymphknoten im Kopf-und Hals und durch die Stimulation der Atemwege Epithel kompliziert sein. Wie bei allen Modellen sollte experimentellen Faktoren wie Dosis-, Fahrzeug-Lieferung, Verteilung des injizierten Materials, Schäden an der respiratorischen Epithels und Auswirkungen der Narkose alle als beim Entwerfen Versuche. Im Vergleich zu den herkömmlichen Verfahren für die es Instillation, glauben wir, dass diese Methode deutlich reduziert Schäden an den Atemwegen Epithel. Dennoch entsprechenden Kontrollgruppen sollten für Verletzungen sein, da Schäden verwendet an der Stelle der Impfung könnte die Lieferung von Antigenen, die Lymphe Knoten 11 zu beeinflussen. Wir empfehlen die Verwendung Kochsalzlösung als ein Fahrzeug, aber wenn das Testmaterial erfordert spezielle Medien für die Wirksamkeit, Fahrzeug Kontrollen sollten nicht vernachlässigt werden. Verteilung der injizierten Partikeln Material in die verschiedenen Lappen der Lunge kann ein wichtiger Parameter für bestimmte Versuche. In solchen Fällen kann jeder der Lappen getrennt unmittelbar darauf folgenden Injektion analysiert werden. Die Verteilung der Materialien in die verschiedenen Lungenlappen darauf folgenden Weg der Instillation wurde von Costa et al 12 beschrieben.
Wir fokussieren unsere Analyse auf die Lymphknoten über die in den meisten Wildtyp zugänglich beschrieben und Knock-out-Stämme von Mäusen in unseren Labors verwendet. Allerdings gibt es zusätzliche Lymphknoten im Bereich der Brustwirbelsäule 13,14, das auch sein könnte analysiert. Wenn mehr Lymphknoten wünschenswert für ein Experiment sind, empfehlen wir erste Identifizierung mittels ip Injektion von fluoreszierenden Kügelchen, wie im Protokoll beschrieben. Zwei der Lymphknoten, die wir empfehlen für die Analyse sind in der Nähe des Thymus daher Vorsicht bei der Extraktion werden sollten.
Wie bereits erwähnt, kann diese Methode angepasst an Lunge, um eine Vielzahl von infektiösen Organismen, Allergene oder Giftstoffe ausgesetzt werden. Es bietet eine einfache und konsistente Alternative zu herkömmlichen Routen von Inhalation und schließt die oberen Atemwege. Es ist besonders nützlich für Experimente, die sich auf Ereignisse, die in die Lunge und die Lunge Lymphknoten vor allen anderen Ort zu initiieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell stariner | BD Biosciences | ||
| Aniline Blue | Fisher Scientific | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington Biochemical | ||
| Collagenase D | Roche Group | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc. | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc. | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | Welch Allyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd, Inc. |
References
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