Summary
Illustriamo non chirurgica consegna dei materiali di prova nei polmoni di topi anestetizzati attraverso la trachea. Questo metodo permette l'esposizione dei polmoni a patogeni batterici e virali, citochine, anticorpi, perline, prodotti chimici o coloranti. Approfondiremo la raccolta ed elaborazione dei polmoni e dei linfonodi polmonari drenante (LDLNs) per la citometria a flusso.
Abstract
Fagociti come i macrofagi alveolari e le cellule dendritiche del polmone (PMA) in continuo campione antigeni dagli spazi alveolari dei polmoni. PMA, in particolare, sono noti a migrare verso i nodi polmone drenaggio linfatico (LDLNs) dove sono presenti gli antigeni inalati alle cellule T di avviare un'adeguata risposta immunitaria a una varietà di immunogeni 1,2. Alle interazioni modello tra i polmoni e gli antigeni aeree nei topi, gli antigeni può essere somministrato per via intranasale 1,3,4, intratracheally 5 o sotto forma di aerosol 6. Consegna da ogni tracciato prevede distinte competenze tecniche e limitazioni che devono essere considerati prima di progettare un esperimento. Per esempio, l'esposizione intranasale e aerosol antigeni offre ad entrambi i polmoni e il tratto respiratorio superiore. Quindi antigeni possono accedere al tessuto linfoide associato nasale (NALT) 7, potenzialmente complicare l'interpretazione dei risultati. Inoltre, la deglutizione, lo starnuto e la frequenza respiratoria del mouse può anche portare a incongruenze nelle dosi consegnate. Anche se il coinvolgimento del tratto respiratorio superiore può essere preferito per alcuni studi, può complicare esperimenti concentrandosi sugli eventi specificamente avviata nei polmoni. In questa impostazione, il intratracheale (it) percorso è preferibile in quanto offre materiali di prova direttamente nei polmoni e ignora il NALT. Molti protocolli di iniezione coinvolgere l'intubazione sia cieco della trachea attraverso la cavità orale o esposizione chirurgica della trachea per accedere ai polmoni. Qui, descriviamo un semplice, coerente, metodo non chirurgico per esso l'instillazione. L'apertura della trachea è visualizzata utilizzando un laringoscopio e un ago piegato sonda viene quindi inserito direttamente nella trachea di consegnare il innoculum. Abbiamo anche descrivere le procedure per la raccolta ed elaborazione dei LDLNs e polmoni per l'analisi del traffico di antigeni in citometria a flusso.
Protocol
1. Prima del processo, preparare e raccogliere i seguenti elementi
- Si prega di fare riferimento all'immagine della Figura 1a) e 1b) per la costruzione di una piattaforma di legno per trattenere il mouse durante la procedura.
- Mix di digestione per linfonodi - HBSS + 1.25mg/ml Collagenasi TypeIV o 2,5 mg / ml Collagenasi D
- Mix di digestione per i polmoni - HBSS + 1 mg / ml Collagenasi
- Diluire sfere di lattice (1:20) in PBS per iniezione intraperitoneale di visualizzare i LDLNs
Nota: LDLNs sono piccoli e difficili da trovare. Per informazioni su come trovarli, iniettare 200μl della diluito 1:20 sfere di lattice rosso fluorescente ip nel topo. Il peritoneo fognature a questi LDLNs 8. 24 HPI, esporre la cavità toracica del mouse come descritto sopra. Il LDLNs apparirà rosa le perline che drenato dalla cavità peritoneale.
- Globuli rossi (RBC) Lysis Buffer - 0,15 m NH 4 Cl, 10mM KHCO 3, 0.1 mM Na 2 EDTA in 1L dH 2 0. Regolare il pH a 7,2-7,4 e conservare a temperatura ambiente.
- Cellula filtro 70μm o 100μm
- Soluzione madre di 0.5M EDTA, pH = 8.0
- HBSS senza CaCl 2 e MgCl 2
- Forbici e blunt-ended forcipe
- Laringoscopio
- Gavage ago (22 gauge) piegato ad angolo (Figura 2)
- Styrofoam bordo e perni per la diffusione del mouse
- Bilancia a due piatti in alto
- Anilina blu Soluzione - 10 mg in H 2 O
Nota: Useremo questa soluzione per la dimostrazione di esso tecnica di iniezione.
2. Preparazione e la somministrazione di anestetici del mouse
- Preparare una miscela di xylazina e ketamina in PBS sterile in modo che le concentrazioni finali sono 2mg/ml e 10mg/ml rispettivamente.
- Pesare il mouse su un equilibrio pan superiore.
- Calcolare la dose richiesta per ogni mouse. Dose alla xylazina (2-4 mg / kg) e ketamina (70-80 mg / kg) di peso corporeo in giusto volume della miscela preparata e iniettare intaperitoneally. Ogni ceppo di topi può richiedere l'ottimizzazione di anestetico. Topi riceve troppo anestetico può avere un tasso ridotto respirazione che potrebbe essere fatale dopo inoculo viene instillata nei polmoni.
- Dopo 3-5 minuti, osservare il mouse per gli effetti degli anestetici. Controllare i seguenti segni per confermare che il mouse è completamente anestetizzato:
- Il tasso di respirazione dovrebbe rallentare.
- Il mouse non dovrebbe allungare il suo braccio quando preso per il collo.
- Non ci dovrebbe essere alcuna risposta quando gli arti posteriori sono stimolati.
Se questi criteri non sono soddisfatti, attendere per qualche minuto e controllare di nuovo prima di procedere alla fase successiva.
3. Iniezione intratracheale
- Preparare il innoculum in soluzione salina 50μl. Riempire una siringa da 1ml con ago sterile sonda gastrica piegato con il innoculum. La siringa deve essere caricata con una tasca d'aria 100μl dietro la innoculum per assicurare che tutto il fluido è instillato nei polmoni.
- Posizionare il mouse sulla piattaforma inclinata di legno appeso dai suoi incisivi sul filo e delicatamente trattenere sul posto con un pezzo di nastro.
- Accendere il laringoscopio con la mano sinistra (destra se siete mancini) e prendere un paio di pinze smussato finita. Utilizzare la punta del laringoscopio e pinza per sollevare delicatamente aprire la bocca.
- Con la pinza, tirare la lingua fuori e tenerlo da parte. Guida la lama laringoscopio verso la parte posteriore della bocca. Tenere il laringoscopio premuto molto delicatamente in un angolo di 90 ° fino a vedere l'apertura della trachea. Tenere il laringoscopio a posto. Si deve prestare attenzione quando si tira la lingua dalla bocca e questo dovrebbe essere fatto con delicatezza in modo che nessun danno tissutale si verifica.
- Con l'altra mano, prendere la siringa da 1 ml contenente il innoculum, dotato di sonda gastrica l'ago piegato con le mani a destra e inserire l'ago nella trachea fino a quando la curva è l'ago dalla incisivi davanti. Spingere il pistone in modo uniforme di consegnare il innoculum. Il innoculum non bolla. Estrarre l'ago della trachea nel più breve tempo possibile. I topi si soffoca e muore, se la trachea è bloccata per troppo tempo. Tenere il mouse in posizione verticale per qualche secondo per permettere innoculum di essere inalate nei polmoni.
- Prendete il mouse fuori della piattaforma e vicino ad una lampada riscaldante. Non lasciare i topi sotto il fuoco diretto per lunghi periodi di tempo. Il mouse dovrebbe essere pienamente sveglio entro 30 minuti dopo la procedura (tempi di recupero possono variare in base ceppi). I topi devono essere osservati diligentemente durante questo tempo e non deve essere consentito di avere troppo caldo o troppo freddo, potrebbe anche mettere i topi in distress respiratorio che portano alla morte.
4. La raccolta e la lavorazione del polmone linfonodi drenanti e polmoni per citometria a flusso
- Sacrificio topo, utilizzando il metodo desiderato secondo le linee guida del AVMA eutanasia. Questo può variare a seconda dei risultati raccolti individuali. Somministrazione di un letale non di sodio pentobarbital è un esempio di una procedura di eutanasia appropriata. Non abbiamo visto gli effetti negativi polmonare di eutanasia da parte di CO 2.
- Pin le braccia e le gambe su una tavola di dissezione. Fare un'incisione lungo il centro del lato ventrale con le forbici. Tirare delicatamente la pelle ed esporre i muscoli della parete toracica.
- Praticare incisioni attraverso i muscoli della parete toracica per esporre gli organi addominali.
- Tenere la punta dello sterno, con la pinza e perforare la membrana. Tagliare la membrana lungo i lati della gabbia toracica.
- Con le forbici parallele alla superficie della scheda dissezione, tagliare la cavità toracica lungo il dorso-ventrale linea su entrambi i lati.
- Sollevare leggermente la gabbia toracica in su. Sul lato destro del cuore, proprio sotto il timo, cercare due linfonodi. Un nodo leggermente più grande linfa terzo si trovano sotto un piccolo vaso arterioso che corre perpendicolare alla trachea. Linfonodi raccolta in 1 ml di mix di digestione dei linfonodi.
- Dopo la raccolta i linfonodi, tenere il cuore con un paio di pinze e afferrare i polmoni con un altro. Polmoni raccolta in 3 ml di ghiaccio PBS freddo in un 6-pozzetti.
- Separare i lobi dei polmoni, aspirare PBS e tagliare i lobi in piccoli pezzi con pinze e forbici. Aggiungere 3 ml della miscela di digestione per i polmoni. Tenere il 6 pozzetti sul ghiaccio durante questa fase.
- Incubare i linfonodi per 25-30 min e polmoni per 30 minuti a 37 ° C. Aggiungi EDTA a una concentrazione finale di 10mM a ciascuna delle miscele di digestione per bloccare la reazione e il luogo sul ghiaccio.
- Utilizzando una siringa da 3 ml, passare i pezzi di polmoni attraverso un ago 18GA 3 volte. Mash i pezzi dei polmoni e il LNs attraverso 70-100μm filtri cellulare utilizzando il back-end di un stantuffo della siringa da 1 ml. Lavare i filtri cella con 10 ml di HBSS senza Ca 2 + e Mg 2 +. Centrifugare a 500 xg per 5 min.
- Risospendere il pellet in 5 ml di tampone di lisi e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 10 ml di HBSS senza Ca 2 + e Mg 2 + per placare la lisi. Centrifugare a 500 xg per 5 min. Portare il polmone e sospensioni cellulari LDLN singola 10ml e 5 ml, rispettivamente. Contare le cellule vive usando un emocitometro per esclusione trypan blu. Le cellule sono ora pronti a macchia di citometria a flusso. 1 lobo del polmone potrebbe essere sufficiente per la citometria a flusso. Lobi altri possono essere utilizzati per altre questioni sperimentali all'interno del mouse stesso, come omogenati di citochine o di tessuto per esame istologico.
5. Rappresentante dei risultati:
PMA e macrofagi alveolari dei polmoni acquisire antigene dagli spazi alveolari dei polmoni immediatamente dopo l'iniezione. La figura 3 mostra la percentuale di CD11c + (espresso sulla PMA e macrofagi alveolari), le cellule che sono positivi per spore di Bacillus anthracis fluorescente, 30 minuti dopo che l'iniezione. In questo momento, ~ 15,9% di CD45 + + CD11c cellule nella sospensione singola cellula del polmone nutrito spore Bacillus anthracis (Figura 3, pannelli inferiori). Per un'ulteriore caratterizzazione di cellule CD11c + nei polmoni, fare riferimento a Kim e Braciale 4. Perline fluorescente sono normalmente utilizzati per valutare il traffico di antigeni particolato LDLNs 9. Per valutare questo trasporto dai polmoni al LDLNs, fluorescente sfere di lattice che sono stati iniettati con LPS e LDLNs sono stati analizzati a 24 HPI. Circa il 4% delle cellule CD11c hi nel LDLNs ospitava perline fluorescenti a 24hpi (Figura 4). Questi esperimenti dimostrano che questo rappresentante protocollo può essere efficacemente utilizzato per tenere traccia delle cellule che acquisiscono antigeni particelle inalate nei polmoni e, successivamente, li il traffico verso il LDLNs.
Figura 1. Piattaforma di legno per immobilizzare i topi durante lo iniezione. Un blocco di legno è stato tagliato in un angolo e barre di metallo sono stati montati, la facciata figura 1a) e 1b vista laterale figura). Un piccolo pezzo di filo era avvolto intorno alla barra di metallo per ancorare gli incisivi davanti al mouse. Un pezzo di nastro è stato fissato alla piattaforma di legare attorno al mouse per mantenere in posizione durante la procedura.
Figura 2. Aghi sonda gastrica per esso iniezione. Un ago sonda gastrica (a destra) è stato piegato ad un angolo di ~ 135 ° (a sinistra) per lo iniezione.
Figura 3. Percentuale di tutte le cellule + CD11c nei polmoni che lo porto GFP iniettato esprimere Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), sfida dopo 5 ore. AJ topi sono stati sfida con 1x10 8 GFP-spore di Bacillus anthracis ei polmoni sono stati analizzati presso l'infezione dopo 5 ore. I grafici mostrano punto percentuale di CD11c + cellule dei polmoni che sono positivi per il Bacillus anthracis.
Figura 4. Rilevamento di perline fluorescenti (giallo / verde) nel polmone linfonodo drenante 24 ore successive i. Iniezione t. AJ topi sono stati trattati con PBS (pannello di sinistra) o 5x10 9 Fluoresbrite YG Microsfere (0.5μm) con 10μg LPS (pannello di destra) sono stati analizzati e LDLNs 24hpi. Rappresentante trame dot mostrare la percentuale di cellule CD11c hi nel LDLNs che porto perline fluorescenti tramato contro un canale vuoto.
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Discussion
Abbiamo utilizzato questo protocollo per studiare il traffico di spore di Bacillus anthracis dai polmoni al LDLNs. Per le applicazioni simili, il numero di particelle consegnato ai polmoni dovrebbero essere scelti con cura in modo che il materiale iniettato può essere rilevato nel LDLNs mediante citometria di flusso. Abbiamo anche utilizzato con successo questo metodo per il trasferimento adottivo di cellule e l'etichettatura delle popolazioni specifiche cellule del polmone utilizzando anticorpi fluorescente. Inoltre, questo metodo viene solitamente usata per amministrare bleomicina (un induttore chimico di fibrosi polmonare) e citochine direttamente nei polmoni 10.
Anche se questo metodo permette di consegna costante di materiali di prova nei polmoni, si richiede una formazione ampia e di validazione (ottenuto instillando colorante nei polmoni). Questo metodo non può avere la stessa rilevanza fisiologica come le altre vie di inalazione perché esclude il tratto respiratorio superiore, dove le interazioni importanti e la risposta immunitaria può essere avviata. Tuttavia, è preferibile cui interpretazione può essere complicata dalla diffusione dell'agente amministrata da linfonodi regionali nella testa e nel collo e attraverso la stimolazione dell'epitelio delle vie respiratorie. Come per tutti i modelli, fattori sperimentali come la dose, veicolo per la consegna, la distribuzione del materiale iniettato, danni all'epitelio respiratorio con effetti dell'anestesia dovrebbero essere considerati durante la progettazione di esperimenti. Rispetto alle procedure tradizionali per essa l'instillazione, crediamo che questo metodo riduce notevolmente i danni all'epitelio delle vie respiratorie. Tuttavia, i gruppi di controllo appropriate devono essere utilizzati per tenere conto di pregiudizio, poiché i danni al sito di inoculazione potrebbe influenzare la consegna degli antigeni ai linfonodi 11. Si consiglia di utilizzare soluzione salina come un veicolo, ma se il materiale di prova richiede un supporto specifico per l'efficacia, comandi del veicolo non deve essere trascurato. Distribuzione del materiale particolato iniettato nella diversi lobi dei polmoni potrebbe essere un parametro importante per alcuni esperimenti. In questi casi, ognuno dei lobi possono essere analizzati separatamente subito dopo lo iniezione. La distribuzione di materiali in diversi lobi dei polmoni successivo percorso di instillazione è stato descritto da Costa et al 12.
Ci concentriamo la nostra analisi sui linfonodi drenanti sopra descritti che sono accessibili in forma più selvaggia e buttare giù i ceppi di topi utilizzati nei nostri laboratori. Tuttavia, ci sono altri linfonodi drenanti nella regione toracica 13,14 che potrebbe anche essere analizzati. Se i linfonodi sono più desiderabile per un esperimento, si consiglia di identificazione iniziale tramite iniezione ip di perline fluorescenti, come descritto nel protocollo. Due dei linfonodi che si consiglia per l'analisi sono in prossimità del timo, pertanto si deve prestare attenzione durante l'estrazione.
Come accennato in precedenza, questo metodo può essere adattato per esporre i polmoni ad una varietà di organismi infettivi, allergeni o tossine. Fornisce un'alternativa semplice e coerente alle rotte tradizionali di esposizione per inalazione ed esclude le vie respiratorie superiori. E 'particolarmente utile per gli esperimenti che si concentrano sugli eventi che avviano nei polmoni e il drenaggio linfonodi polmonari prima di qualsiasi altro sito.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell stariner | BD Biosciences | ||
| Aniline Blue | Fisher Scientific | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington Biochemical | ||
| Collagenase D | Roche Group | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc. | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc. | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | Welch Allyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd, Inc. |
References
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