Summary
We illustreren niet-chirurgische levering van testmateriaal in de longen van verdoofde muizen via de luchtpijp. Deze methode laat long blootstelling aan bacteriële en virale pathogenen, cytokines, antistoffen, kralen, chemicaliën of kleurstoffen. We verder beschrijven oogst en verwerking van de longen en longen drainerende lymfeklieren (LDLNs) voor flowcytometrie.
Abstract
Fagocyterende cellen zoals alveolaire macrofagen en longen dendritische cellen (MOL's) continu monster antigenen van de alveolaire ruimten in de longen. MOL, in het bijzonder, staan bekend om te migreren naar de longen drainerende lymfeklieren (LDLNs), waar zij aanwezig is ingeademd antigenen aan T-cellen het openen van een juiste immuunreactie op een verscheidenheid van immunogenen 1,2. Voor het modelleren van interacties tussen de longen en in de lucht antigenen in muizen, kunnen antigenen intranasaal 1,3,4 worden toegediend, intratracheaal 5 of de vorm van aërosolen 6. Levering door elke route houdt in verschillende technische vaardigheden en beperkingen die moeten worden genomen voordat het ontwerpen van een experiment. Bijvoorbeeld, intranasale en aerosolized blootstelling levert antigenen aan zowel de longen en de bovenste luchtwegen. Vandaar dat antigenen kunnen toegang krijgen tot de neus daarmee verbonden lymfoïd weefsel (nalt) 7, potentieel bemoeilijkt de interpretatie van de resultaten. Daarnaast kunnen slikken, niezen en de ademhaling van de muis ook leiden tot inconsistenties in de geleverde doses. Hoewel de betrokkenheid van de bovenste luchtwegen kan de voorkeur voor sommige studies, kan het bemoeilijken experimenten gericht op gebeurtenissen die specifiek ingewijd in de longen. In deze instelling van de intratracheale (het) route de voorkeur omdat het testen van materialen levert direct in de longen en omzeilt de nalt. Velen injectie protocollen betrekking hebben op een blinde intubatie van de luchtpijp via de mondholte of chirurgische blootstelling van de luchtpijp naar de longen te openen. Hierin beschrijven we een eenvoudige, consistente, niet-chirurgische methode voor het instillatie. De opening van de luchtpijp wordt gevisualiseerd met behulp van een laryngoscoop en een gebogen naald maagsonde wordt dan rechtstreeks in de luchtpijp naar de innoculum te leveren. We beschrijven ook de procedures voor het oogsten en verwerken van LDLNs en longen voor de analyse van antigeen handel door flowcytometrie.
Protocol
1. Voordat het proces, voor te bereiden en het verzamelen van de volgende items
- Verwijzen wij u naar het beeld in figuur 1a) en 1b) voor het bouwen van een houten platform om de muis te beperken tijdens de procedure.
- Spijsvertering mix voor lymfeklieren - HBSS + 1.25mg/ml Collagenase TypeIV of 2,5 mg / ml Collagenase D
- Spijsvertering mix voor de longen - HBSS + 1 mg / ml Collagenase
- Verdunnen latex kralen (01:20) in PBS voor intraperitoneale injectie aan het LDLNs visualiseren
Let op: LDLNs zijn klein en moeilijk te vinden. Om te leren hoe ze te vinden, injecteren 200μl van de 1:20 verdunde rode tl-latex bolletjes ip in de muis. Het buikvlies drains om deze LDLNs 8. 24 hpi, bloot de borstholte van de muis zoals hierboven beschreven. Het zal LDLNs blijkt roze van de parels die afgevoerd uit de buikholte.
- Rode Bloedcellen (RBC) Lysis Buffer - 0,15 M NH 4 Cl, 10mm KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA in 1L dH 2 0. Pas de pH op 7,2-7,4 en bewaar bij kamertemperatuur.
- 70μm of 100 urn zeef cel
- Stock oplossing van 0,5 M EDTA, pH = 8,0
- HBSS zonder CaCl 2 en MgCl 2
- Schaar en stompe tang
- Laryngoscoop
- Maagsonde naald (22 gauge) gebogen in een hoek (figuur 2)
- Styrofoam boord en pinnen voor het verspreiden van de muis
- Top pan balans
- Aniline Blue Oplossing - 10mg/ml in H 2 O
Opmerking: Wij zullen het gebruik van deze oplossing voor het aantonen van het injectie-techniek.
2. Bereiding en toediening van de muis verdoving
- Maak een mengsel van Xylazine en ketamine in steriele PBS, zodat de uiteindelijke concentraties zijn respectievelijk 2mg/ml en 10mg/ml.
- Weeg de muis op een top pan balans.
- Bereken de dosis die nodig is voor elke muis. Dosis op Xylazine (2-4 mg / kg) en ketamine (70-80 mg / kg) lichaamsgewicht met geschikte volume van de bereide mengsel en injecteer intaperitoneally. Elke muizenstam kan eisen optimalisatie van de verdoving. Muizen die te veel verdoving kunnen een verminderde ademhaling tarief dat fataal kan zijn na het inoculum wordt bijgebracht in de longen.
- Na 3-5 minuten, leven zij de muis voor de effecten van de narcose. Controleer op de volgende borden te bevestigen dat de muis is volledig verdoofd:
- De ademhaling moet vertragen.
- De muis moet niet strekken haar arm toen opgepikt door de nek.
- Er mag geen reactie wanneer de achterste ledematen worden gestimuleerd.
Als deze criteria niet wordt voldaan, wacht een paar minuten en controleer opnieuw voordat u verder gaat met de volgende stap.
3. Intratracheale injectie
- Bereid de innoculum in 50μl zoutoplossing. Vul een 1ml injectiespuit voorzien van een steriele gebogen maagsonde naald met de innoculum. De spuit moet worden geladen met een 100μl luchtzak achter de innoculum om ervoor te zorgen dat alle van de vloeistof wordt bijgebracht in de longen.
- Plaats de muis op de schuine houten platform opknoping door zijn snijtanden op de draad en het voorzichtig te beperken in plaats met een stuk lint.
- Zet de laryngoscoop met je linkerhand (als je rechts bent overhandigd) en pak een paar stompe einde tang. Gebruik de punt van laryngoscoop en de tang voorzichtig wrikken de mond open.
- Met de tang, trek de tong uit en houd hem aan de kant. Leid de laryngoscoop blad naar de achterkant van de mond. Houd de laryngoscoop ingedrukt heel voorzichtig in een hoek van 90 ° tot u de opening van de luchtpijp. Houd de laryngoscoop op zijn plaats. Voorzichtigheid is geboden bij het trekken van de tong uit de mond en dit moet voorzichtig gebeuren zodat er geen weefsel schade optreedt.
- Met uw andere hand, neem dan de 1 ml spuit met de innoculum, uitgerust met de gebogen naald maagsonde met uw rechter handen en steek de naald in de luchtpijp tot aan de bocht van de naald wordt door de voorste snijtanden. Gelijkmatig Duw de zuiger om de innoculum te leveren. De innoculum mag geen zeepbel. Trek de naald uit de luchtpijp zo snel mogelijk. Muizen zullen stik en sterven als de luchtpijp geblokkeerd is te lang. Houd de muis voor een paar seconden om innoculum te worden geïnhaleerd in de longen.
- Haal de muis uit het platform en plaats het in de buurt van een warmtelamp. Laat geen muizen onder directe warmte voor langere tijd. De muis moet volledig wakker te worden binnen 30 minuten na de procedure (hersteltijd kan variëren op basis van stammen). Muizen te ijverig in acht worden genomen in deze tijd en mag niet worden toegestaan om te warm of te koud is, kan dit ook zet de muizen in ademnood leiden tot de dood.
4. Oogsten en verwerken Lung drainerende lymfeklieren en de longen voor flowcytometrie
- Offer muizen met de gewenste methode conform de AVMA euthanasie richtlijnen. Dit kan variëren afhankelijk van de individuele oogst resultaten. Toediening van een dodelijke doet van natriumpentobarbital is een voorbeeld van een geschikte euthanasie procedure. We hebben niet gezien negatieve pulmonale effecten van euthanasie door CO 2.
- Pin van de armen en benen aan een dissectie boord. Maak een incisie langs het midden van de ventrale zijde met een schaar. Trek de huid en bloot te leggen van de thoraxwand spieren.
- Maak incisies door de thoraxwand spieren om de buikorganen bloot te leggen.
- Houd de punt van het borstbeen met de tang en prik het middenrif. Knip het membraan langs de zijkanten van de ribbenkast.
- Met de schaar parallel aan de dissectie bord oppervlak, dwars door de borstholte langs de dorso-ventrale lijn aan beide kanten.
- Iets hoger optillen van de ribbenkast. Aan de rechterkant van het hart, net onder de thymus, op zoek naar twee lymfeklieren. Een iets grotere derde lymfeklieren bevindt zich onder een klein arterieel bloedvat dat loodrecht op de luchtpijp. Oogst lymfeklieren in 1 ml van de lymfeklier spijsvertering mix.
- Na het oogsten van de lymfeklieren, houdt u het hart met een pincet en pak de longen met een ander. Oogst longen naar 3 ml van de ijskoude PBS in een 6-wells plaat.
- Scheid de lobben van de longen, aspireer PBS en hak de lobben in kleine stukjes met behulp van een tang en schaar. Voeg 3 ml van de spijsvertering mix voor longen. Houd de 6-wells plaat op het ijs tijdens deze stap.
- Incubeer de lymfeklieren voor 25-30 min en longen gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Voeg EDTA tot een uiteindelijke concentratie van 10 mM aan elk van de spijsvertering mengsels om de reactie en plaats deze op ijs te stoppen.
- Met behulp van een 3 ml spuit, langs delen van de longen door middel van een naald 18GA 3 keer. Pureer de stukjes van de longen en de LNS door middel van 70-100 urn cel zeven met behulp van de achterkant van een 1 ml spuit zuiger. Was de cel zeven met 10 ml van HBSS zonder Ca 2 + en Mg 2 +. Centrifugeer op 500 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de pellet in 5 ml RBC lysis buffer en incubeer gedurende 3 min bij kamertemperatuur. Voeg 10 ml van HBSS zonder Ca 2 + en Mg 2 + tot lysis lessen. Centrifugeer op 500 xg gedurende 5 minuten. Brengen de longen en LDLN single celsuspensies tot 10 ml en 5 ml respectievelijk. Count levende cellen met behulp van een hemacytometer door trypan blauw uitsluiting. Cellen zijn nu klaar om vlek voor flowcytometrie. Een lob van de long kan voldoende zijn voor flowcytometrie. Andere lobben kan gebruikt worden voor andere experimentele vragen in dezelfde muis, zoals homogenaten voor cytokinen of weefsel voor histologie.
5. Representatieve resultaten:
Minst ontwikkelde landen en alveolaire macrofagen in de longen te verwerven antigeen van de alveolaire ruimten van de longen direct na het injectie. Figuur 3 toont het percentage van CD11c + (uitgedrukt op MOL en alveolaire macrofagen) cellen die positief zijn voor fluorescent gelabelde Bacillus anthracis sporen, 30 min na het injectie. Op dit moment is ~ 15,9% van de CD45 + CD11c + cellen in de longen enkele celsuspensie koesterde Bacillus anthracis sporen (figuur 3, onderste panelen). Voor verdere karakterisering van CD11c + cellen in de longen, zie Kim en Braciale 4. Fluorescent gelabelde kralen worden routinematig gebruikt om de smokkel van deeltjes antigenen te beoordelen LDLNs 9. Om dit te beoordelen transport vanuit de longen naar LDLNs, fluorescerend gemaakt latex bolletjes geïnjecteerd met LPS en LDLNs werden geanalyseerd op 24 hpi. Ongeveer 4% van CD11c hi cellen in de LDLNs fluorescerende beads koesterde bij 24hpi (figuur 4). Deze representatieve experimenten tonen aan dat dit protocol kan efficiënt worden gebruikt om de cellen die antigenen ingeademde deeltjes te verwerven track in de longen en vervolgens het verkeer ze naar de LDLNs.
Figuur 1. Houten platform voor het fixeren muizen tijdens het injecteren. Een houten blok werd gesneden in een hoek en metalen staven werden gemonteerd, vooraanzicht figuur 1a) en zijaanzicht figuur 1b). Een klein stukje draad was gewikkeld de metalen buis aan de voorkant snijtanden van de muis anker. Een stukje van het lint was verbonden aan het platform te binden rond de muis te houden op zijn plaats tijdens de procedure.
Figuur 2. Maagsonde naald voor het injecteren. Een maagsonde naald (rechts) was gebogen in een hoek van ~ 135 ° (links) voor het injectie.
Figuur 3. Percentage van alle CD11c + cellen in de longen dat het ingespoten GFP uiten van Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), 5 uur na de uitdaging haven. AJ muizen werden uitdaging met 1x10 8 GFP-Bacillus anthracis sporen en de longen werden geanalyseerd op 5 uur na infectie. De stip kavels tonen percentage van CD11c + long cellen die positief zijn voor Bacillus anthracis.
Figuur 4. Detectie van fluorescerende kralen (geel / groen) in de long drainerende lymfeklieren 24 uur na de i. T injectie. AJ muizen kregen ofwel PBS (linker paneel) of 5x10 9 Fluoresbrite YG microsferen (0.5μm) met 10μg LPS (rechter paneel) het en LDLNs werden geanalyseerd 24hpi. Vertegenwoordiger dot plots tonen percentage van CD11c hi cellen in de LDLNs dat de haven fluorescerende beads uitgezet tegen een leeg kanaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben dit protocol gebruikt om de smokkel van Bacillus anthracis sporen van de longen naar de LDLNs bestuderen. Voor soortgelijke toepassingen, moet het aantal deeltjes geleverd aan de longen zorgvuldig worden gekozen, zodat de geïnjecteerde materiaal kan worden gedetecteerd in de LDLNs door flowcytometrie. We hebben ook met succes gebruik gemaakt van deze methode voor adoptieve overdracht van cellen en etikettering van specifieke long celpopulaties met behulp van fluorescent gelabelde antilichamen. Bovendien is deze methode routinematig gebruikt om bleomycine (een chemische inductor van longfibrose) en cytokinen direct in de longen 10.
Hoewel deze methode maakt het mogelijk consistente levering van testmateriaal in de longen, het vereist een uitgebreide opleiding en de erkenning (bereikt door het bijbrengen kleurstof in de longen). Deze methode kan niet dezelfde fysiologische relevantie als andere routes van inademing, want het sluit de bovenste luchtwegen waar belangrijke interacties en immuunreacties kan worden gestart. Toch verdient het de voorkeur waar de interpretatie kan worden bemoeilijkt door opname van de toegediende middel door de regionale lymfeklieren in het hoofd en nek en door stimulatie van de luchtwegen epitheel. Zoals bij alle modellen, moet experimentele factoren zoals de dosis, het voertuig voor de levering, de distributie van het geïnjecteerde materiaal, schade aan de luchtwegen epitheel en de effecten van anesthesie alle worden beschouwd, terwijl het ontwerpen van experimenten. In vergelijking met de conventionele procedures voor het indruppelen, zijn wij van mening dat deze methode veel schade aan de luchtwegen epitheel vermindert. Toch passende controle-groepen moeten worden gebruikt om de rekening voor de schade, omdat beschadiging op de plaats van inenting kunnen invloed hebben op de levering van antigenen naar de lymfeklieren 11. Wij raden u aan zout als een voertuig, maar als het testmateriaal vereist specifieke media voor de effectiviteit, bedieningsorganen van het voertuig mag niet worden verwaarloosd. Verspreiding van de geïnjecteerde deeltjes materiaal in de verschillende lobben van de longen kan een belangrijke parameter voor bepaalde experimenten. In dergelijke gevallen kan elk van de lobben worden geanalyseerd apart onmiddellijk na het injectie. De distributie van de materialen in de verschillende lobben van de longen na het route van toediening is beschreven door Costa et al. 12.
We richten onze analyse van de drainerende lymfeklieren hierboven beschreven die toegankelijk zijn in de meeste wild-type en de knock-out muizen, die in onze labs. Echter, er zijn extra drainerende lymfeklieren in de thoracale regio 13,14, die ook zouden kunnen worden geanalyseerd. Als er meer lymfeklieren zijn wenselijk voor een experiment, raden wij initiële identificatie met behulp van ip injectie van TL-parels, zoals beschreven in het protocol. Twee van de lymfeklieren die wij aanbevelen voor analyse zijn in de nabijheid van de thymus daarom zorg moeten worden genomen tijdens de extractie.
Zoals eerder vermeld, kan deze methode worden aangepast aan de longen worden blootgesteld aan een verscheidenheid van infectieuze organismen, allergenen of toxines. Het biedt een eenvoudige en consistente alternatief voor de conventionele routes van blootstelling door inademing en sluit de bovenste luchtwegen. Het is met name nuttig voor experimenten die zich richten op gebeurtenissen die starten in de longen en de longen drainerende lymfeknopen vóór elke andere site.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell stariner | BD Biosciences | ||
| Aniline Blue | Fisher Scientific | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington Biochemical | ||
| Collagenase D | Roche Group | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc. | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc. | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | Welch Allyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd, Inc. |
References
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).
- Bar-Haim, E. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).
- Kim, T. S., Braciale, T. J. Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses. PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).
- Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity. J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).
- Thomas, R. J. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. J Med Microbiol. , (2010).
- Kiyono, H., Fukuyama, S. NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).
- Parungo, C. P. Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics. Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).
- Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen. J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).
- Higgins, D. M. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).
- Kool, M. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J Exp Med. 205, 869-869 (2008).
- Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope. Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).
- Takahashi, S., Patrick, G. Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat. Lab Anim. 21, 31-31 (1987).
- Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).
