Summary
Nós ilustramos não-cirúrgico de entrega de materiais de teste para os pulmões de ratos anestesiados através da traquéia. Este método permite a exposição de pulmão a patógenos virais e bacterianas, citocinas, anticorpos, miçangas, químicos ou corantes. Iremos descrever colheita e processamento dos pulmões e dos gânglios linfáticos de drenagem de pulmão (LDLNs) para citometria de fluxo.
Abstract
Células fagocíticas, tais como macrófagos alveolares e células dendríticas pulmonares (PMD) continuamente amostra antígenos dos espaços alveolares nos pulmões. PMD, em particular, são conhecidos a migrar para o pulmão linfonodos de drenagem (LDLNs) onde apresentam antígenos inalados para células T iniciar uma resposta imune apropriada para uma variedade de imunógenos 1,2. Para modelar interações entre os pulmões e antígenos no ar em camundongos, os antígenos podem ser administradas por via intranasal 1,3,4, intratraqueal 5 ou 6 como aerossóis. Entrega por cada rota envolve distintas habilidades técnicas e limitações que precisam ser considerados antes de projetar um experimento. Por exemplo, a exposição intranasal e aerossol oferece antígenos para ambos os pulmões e do trato respiratório superior. Daí antígenos pode acessar o tecido linfóide associado nasal (NALT) 7, potencialmente complica a interpretação dos resultados. Além disso, engolir espirros, ea taxa de respiração do mouse também pode levar a inconsistências nas doses administradas. Embora o envolvimento do trato respiratório superior pode ser preferível para alguns estudos, pode complicar experimentos com foco em eventos especificamente iniciada nos pulmões. Neste cenário, a rota (it) intratraqueal é preferível, uma vez que fornece materiais de teste diretamente para os pulmões e ignora o NALT. Muitos protocolos que envolvem injeção de intubação ou cego da traquéia através da cavidade oral ou exposição cirúrgica da traquéia para acessar os pulmões. Relata-se um simples, consistente, o método não-cirúrgico para que a instilação. A abertura da traquéia é visualizado através de um laringoscópio e uma agulha torta sonda é inserido diretamente na traquéia para entregar o inóculo. Descrevemos também os procedimentos de colheita e processamento de LDLNs e pulmões para a análise do tráfico de antígeno por citometria de fluxo.
Protocol
1. Antes do processo, preparar e recolher os itens a seguir
- Por favor, consulte a imagem da Figura 1a) e 1b) para a construção de uma plataforma de madeira para conter o mouse durante o procedimento.
- Mix digestão para os gânglios linfáticos - HBSS + 1.25mg/ml colagenase TypeIV ou 2,5 mg / ml de colagenase D
- Mix digestão para os pulmões - HBSS + 1 colagenase mg / ml
- Diluir esferas de látex (1:20) em PBS para injeção intraperitoneal para visualizar a LDLNs
Nota: LDLNs são pequenas e difíceis de encontrar. Para saber como encontrá-los, injetar 200μl das 01:20 diluída vermelho esferas de látex fluorescentes ip para o mouse. O peritônio é drenada para essas LDLNs 8. 24 hpi, expor a cavidade torácica do mouse, como descrito acima. O LDLNs aparecerá rosa das contas que drenada da cavidade peritoneal.
- Glóbulos vermelhos (RBC) Tampão de Lise - 0,15 M NH 4 Cl, 10mM KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA em 1L dH 2 0. Ajustar o pH a 7,2-7,4 e armazenar em temperatura ambiente.
- Coador de células 70μm ou 100μm
- Solução estoque de EDTA 0,5 M, pH = 8,0
- HBSS sem CaCl 2 e MgCl 2
- Tesouras e pinças de ponta e
- Laringoscópio
- Agulha de gavage dobrado (calibre 22) em um ângulo (Figura 2)
- Isopor placa e pinos para espalhar o rato
- Equilíbrio pan topo
- Solução de anilina azul - 10mg/ml em H 2 O
Nota: Nós estaremos usando esta solução para a demonstração de que a técnica de injecção.
2. Preparação e administração de anestésico do mouse
- Prepare uma mistura de xilazina e quetamina em PBS estéril, para que as concentrações finais são 2mg/ml e 10mg/ml respectivamente.
- Pesar o mouse em uma balança de prato superior.
- Calcular a dose necessária para cada rato. Dose de Xilazina (2-4 mg / kg) e ketamina (70-80 mg / kg) de peso corporal usando volume apropriado da mistura preparada e injetar intaperitoneally. Cada cepa do mouse pode exigir otimização de anestésico. Camundongos que receberam muito anestésico pode ter uma taxa de respiração reduzida que poderia ser fatal depois de inóculo é instilada nos pulmões.
- Depois de 3-5 minutos, observe o mouse para os efeitos do anestésico. Verifique os seguintes sinais para confirmar que o mouse é totalmente anestesiado:
- A taxa de respiração deve desacelerar.
- O rato não deve esticar seu braço quando pegou pelo pescoço.
- Não deve haver qualquer resposta quando a membros posteriores são estimulados.
Se estes critérios não forem atendidos, espere alguns minutos e verifique novamente antes de prosseguir para a próxima etapa.
3. Injeção intratraqueal
- Preparar o inóculo em salina 50μl. Encher uma seringa de 1ml com uma agulha estéril dobrada gavage com o inóculo. A seringa deve ser carregado com uma bolsa de ar 100μl por trás do inóculo para garantir que todo o líquido é instilado no pulmão.
- Posicione o mouse sobre a plataforma de madeira em ângulo pendurado pelas incisivos no fio e gentilmente contê-lo no lugar com um pedaço de fita.
- Ligue o laringoscópio com a mão esquerda (se você for destro) e pegar um par de fórceps blunt terminou. Use a ponta do laringoscópio e as pinças para gentilmente forçar a abertura da boca.
- Com a pinça, puxar a língua para fora e segure-o para o lado. Guia da lâmina do laringoscópio para a parte traseira da boca. Mantenha o laringoscópio pressionado muito suavemente em um ângulo de 90 ° até ver a abertura da traquéia. Segure o laringoscópio no lugar. Cuidados devem ser tomados quando puxar a língua da boca e isso deve ser feito com cuidado para não danifica o tecido ocorre.
- Com a outra mão, pegue a seringa de 1ml contendo o inóculo, equipado com a agulha torta gavage com as mãos direita e inserir a agulha para dentro da traquéia até a curva da agulha é por os incisivos da frente. Empurre o êmbolo uniformemente para entregar o inóculo. O inóculo não deve bolha. Retire a agulha da traquéia, logo que possível. Camundongos vai sufocar e morrer se a traquéia é bloqueada por muito tempo. Segure o mouse na vertical por alguns segundos para permitir inóculo para ser inalado para os pulmões.
- Leve o mouse para fora da plataforma e colocá-lo perto de uma lâmpada de aquecimento. Não deixe os ratos sob o calor direta por longos períodos de tempo. O mouse deve ser totalmente desperto dentro de 30 min após o procedimento (tempo de recuperação pode variar de acordo com cepas). Camundongos devem ser observados com diligência durante este tempo e não devem ser autorizados a ficar muito quente ou muito frio, isso também poderia colocar os ratos em angústia respiratória levando à morte.
4. Colheita e processamento de pulmão linfonodos drenantes e pulmões para a citometria de fluxo
- Sacrifício camundongos usando o método desejado de acordo com as diretrizes da eutanásia AVMA. Isso pode variar, dependendo dos resultados da colheita individual. Administração de um letal de pentobarbital sódico não é um exemplo de um procedimento de eutanásia apropriado. Não temos visto efeitos negativos pulmonar de eutanásia por CO 2.
- Pin dos braços e pernas em uma placa de dissecção. Faça uma incisão ao longo do meio do lado ventral com uma tesoura. Puxe a pele e expor os músculos da parede torácica.
- Fazer incisões através dos músculos da parede torácica para expor os órgãos abdominais.
- Segure a ponta do esterno com a pinça e punção do diafragma. Corte o diafragma ao longo dos lados da caixa torácica.
- Com a tesoura paralela à superfície da placa de dissecação, corte através da cavidade torácica ao longo da linha dorso-ventral em ambos os lados.
- Levante ligeiramente a caixa torácica para cima. No lado direito do coração, logo abaixo do timo, olhar para dois linfonodos. Um nó de linfa ligeiramente maior terceiro está localizado por baixo um pequeno vaso sanguíneo arterial que corre perpendicular à traquéia. Colheita gânglios linfáticos em 1 ml de linfa mix digestão nó.
- Após a colheita os gânglios linfáticos, segure o coração com uma pinça e pegar os pulmões com o outro. Pulmões colheita em 3 ml de PBS gelado em uma placa de 6 poços.
- Separam os lobos dos pulmões, aspirado PBS e pique os lobos em pedaços pequenos usando uma pinça e tesouras. Adicionar 3 ml da mistura de digestão para os pulmões. Mantenha a placa de 6 poços em gelo durante esta etapa.
- Incubar os linfonodos por 25-30 min e pulmões por 30 min a 37 ° C. Adicionar EDTA para uma concentração final de 10mM de cada uma das misturas digestão para parar a reação e colocar no gelo.
- Usando uma seringa de 3ml, passar pedaços de pulmões através de uma agulha 18GA 3 vezes. Mash as peças dos pulmões e os linfonodos através de filtros de 70 100μm célula usando o back-end de um êmbolo da seringa de 1ml. Lavar os filtros de células com 10 ml de HBSS sem Ca 2 + e Mg 2 +. Centrifugar a 500 xg por 5 min.
- Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão de lise RBC e incubar por 3 min à temperatura ambiente. Adicionar 10 ml de HBSS sem Ca 2 + e Mg 2 + para saciar a lise. Centrifugar a 500 xg por 5 min. Abrir o pulmão e suspensões de células LDLN único para 10ml e 5ml respectivamente. Contagem de células vivas usando um hemocitômetro por exclusão de tripan azul. Células estão agora prontos para mancha de citometria de fluxo. Um lobo do pulmão pode ser suficiente para citometria de fluxo. Outros lobos pode ser usado para outras questões experimentais na mesmo mouse, como homogenatos de citocinas ou tecido para exame histológico.
5. Resultados representativos:
PMA e macrófagos alveolares nos pulmões adquirir antígeno dos espaços alveolares dos pulmões imediatamente a seguir que a injeção. A Figura 3 mostra percentuais de CD11c + (expressa em países menos desenvolvidos e nos macrófagos alveolares), as células que são positivas para os esporos de Bacillus anthracis fluorescente etiquetado, pós 30 min que a injeção. Neste momento, ~ 15,9% de CD45 + CD11c + células em suspensão de células de pulmão único abrigou esporos de Bacillus anthracis (Figura 3, painéis inferiores). Para uma melhor caracterização de células CD11c + nos pulmões, referem-se a Kim e Braciale 4. Fluorescente etiquetado contas são rotineiramente usados para avaliar o tráfico de antígenos particulados para LDLNs 9. Para avaliar este transporte dos pulmões para LDLNs, miçangas fluorescentes de látex foram injetados com LPS e LDLNs foram analisados em 24 hpi. Cerca de 4% de células CD11c oi na LDLNs abrigou partículas fluorescentes em 24hpi (Figura 4). Estas experiências mostram representante que este protocolo pode ser eficientemente usado para rastrear células que adquirir antígenos particulados inalado nos pulmões e, posteriormente, o tráfego los para o LDLNs.
Figura 1. Plataforma de madeira para imobilizar ratos durante a mesma injeção. Um bloco de madeira foi cortada em um ângulo e barras de metal foram instalados, front view figura 1a) e laterais figura 1b vista). Um pequeno pedaço de fio foi enrolado ao redor da barra de metal para ancorar os incisivos frente do mouse. Um pedaço de fita foi anexada à plataforma para amarrar ao redor do mouse para mantê-lo no lugar durante o procedimento.
Figura 2. Gavagem agulha de injeção para ele. Uma agulha gavage (direita) foi dobrada em um ângulo de aproximadamente 135 ° (esquerda) para que a injeção.
Figura 3. Porcentagem de todas as células CD11c + nos pulmões que porto se expressando GFP injetado Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), o desafio pós 5hrs. Camundongos foram AJ desafio com 1x10 8 esporos GFP Bacillus anthracis, e os pulmões foram analisados em 5 horas após a infecção. Os gráficos de pontos mostram porcentagem de CD11c + células do pulmão que são positivos para o Bacillus anthracis.
Figura 4. Detecção de partículas fluorescentes (amarelo / verde) no pulmão linfonodos drenantes 24 horas após a i. Injeção t. AJ ratos receberam ou PBS (painel esquerdo) ou 5x10 9 Fluoresbrite Microesferas YG (0.5μm) com 10μg de LPS (painel direito) que foram analisados e LDLNs 24hpi. Parcelas representativas dot mostram porcentagem de células CD11c oi na LDLNs que contas porto fluorescentes conspiraram contra um canal vazio.
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Discussion
Nós utilizamos esse protocolo para estudo do tráfico de esporos de Bacillus anthracis dos pulmões para o LDLNs. Para aplicações semelhantes, o número de partículas entregues para os pulmões devem ser cuidadosamente escolhidos para que o material injetado pode ser detectado no LDLNs por citometria de fluxo. Temos também utilizado com sucesso este método para a transferência adotiva de células e rotulagem das populações específicas de células do pulmão através de anticorpos fluorescente etiquetado. Além disso, este método é rotineiramente usado para administrar bleomicina (um indutor químico de fibrose pulmonar) e citocinas diretamente para os 10 pulmões.
Embora esse método permite a entrega consistente de materiais de teste para os pulmões, que exige treinamento e validação (atingido por incutir tintura para os pulmões). Este método pode não ter a mesma relevância fisiológica como outras vias de inalação, porque exclui do trato respiratório superior onde as interações importantes e respostas imunes podem ser iniciadas. No entanto, é preferível que a interpretação pode ser complicada pela captação do agente administrado por linfonodos regionais na cabeça e pescoço e pela estimulação do epitélio do trato respiratório. Tal como acontece com todos os modelos, os fatores experimentais, como dose, veículo para a entrega e distribuição do material injetado, danos ao epitélio respiratório e efeitos da anestesia devem ser considerados ao projetar experimentos. Comparado com os procedimentos convencionais para que a instilação, acreditamos que este método reduz significativamente os danos ao epitélio do trato respiratório. No entanto, grupos de controle apropriados devem ser utilizados para contabilizar prejuízo, dado que os danos no local da inoculação podem afetar a entrega de antígenos para os linfonodos 11. Recomendamos o uso de soro fisiológico como um veículo, mas se o material de teste exige meios específicos para a eficácia, comandos do veículo não deve ser negligenciada. Distribuição do material particulado injetada nos lóbulos diferentes dos pulmões pode ser um parâmetro importante para certos experimentos. Em tais casos, cada um dos lobos podem ser analisados separadamente imediatamente após ele injeção. A distribuição de materiais em diferentes lobos dos pulmões após ele via de instilação foi descrito por Costa et al 12.
Focamos nossa análise sobre os linfonodos de drenagem descritas acima, que são acessíveis no tipo mais selvagem e knock out linhagens de camundongos utilizado em nossos laboratórios. No entanto, existem outros linfonodos de drenagem na região torácica 13,14 que também pode ser analisado. Se mais linfonodos são desejáveis para uma experiência, recomendamos identificação inicial usando a injeção ip de partículas fluorescentes, como descrito no protocolo. Dois dos gânglios linfáticos que recomendamos para a análise estão em estreita proximidade com o timo, portanto, cuidados devem ser tomados durante a extração.
Como mencionado anteriormente, este método pode ser adaptado para expor os pulmões de uma variedade de organismos infecciosos, alérgenos ou toxinas. Ela fornece uma alternativa simples e consistente às rotas convencionais de exposição por inalação e exclui o trato respiratório superior. É particularmente útil para experimentos que se concentram em eventos que iniciam nos pulmões eo pulmão linfonodos de drenagem antes de qualquer outro site.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell stariner | BD Biosciences | ||
| Aniline Blue | Fisher Scientific | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington Biochemical | ||
| Collagenase D | Roche Group | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc. | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc. | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | Welch Allyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd, Inc. |
References
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