Summary
אנו מדגימים לא ניתוחי מסירה של חומרי הבדיקה לריאות של העכברים הרדים דרך קנה הנשימה. שיטה זו מאפשרת חשיפה הריאות לפתוגנים, ציטוקינים חיידקים ווירוסים, נוגדנים, חרוזים, כימיקלים, או צבעים. בנוסף, אנו מתארים קציר ועיבוד של הריאות ניקוז ריאה בלוטות לימפה (LDLNs) עבור cytometry הזרימה.
Abstract
תאים Phagocytic כגון מקרופאגים מכתשיים ריאות תאים דנדריטים ו (LDCs) ברציפות מדגם אנטיגנים מן החללים מכתשיים בריאות. LDCs, בפרט, ידועים להגר ריאה בלוטות הלימפה לנקז (LDLNs) שבו הם מציגים אנטיגנים לתאי T בשאיפה ליזום תגובה חיסונית מתאימה למגוון immunogens 1,2. כדי אינטראקציות בין מודל הריאות אנטיגנים הנישאים באוויר בעכברים, אנטיגנים יכול להינתן intranasally 1,3,4, intratracheally 5 או 6 אירוסולים. משלוח על ידי תוואי זה כרוך מיומנויות טכניות שונות ואת המגבלות שצריכות להיחשב לפני תכנון ניסוי. לדוגמה, חשיפה intranasal ו aerosolized מספק אנטיגנים הן הריאות בדרכי הנשימה העליונות. לפיכך אנטיגנים יכולים לגשת רקמות האף הקשורים הלימפה (NALT) 7, פוטנציאל סיבוך הפרשנות של התוצאות. בנוסף, בליעה, התעטשות לבין קצב הנשימה של העכבר עשויה גם להוביל הסתירות במינונים נמסר. למרות מעורבות של דרכי הנשימה העליונות עלול להיות המועדפת עבור מחקרים, זה יכול לסבך ניסויים התמקדות באירועים יזם במיוחד בריאות. בהגדרה זו, את המסלול intratracheal (זה) עדיף כפי שהוא מספק חומרים מבחן ישירות לתוך הריאות עוקף את NALT. פרוטוקולים רבים זה כרוך הזרקה אינטובציה עיוור או של קנה הנשימה דרך חלל הפה או חשיפה כירורגית של קנה הנשימה כדי לגשת הריאות. בזאת, אנו מתארים פשוטה, עקבית, לא ניתוחי שיטת החדרה זה. פתיחת קנה הנשימה הוא מדמיין באמצעות ראי גרון ומחט gavage כפוף מוכנס אז ישירות לתוך קנה הנשימה כדי לספק את innoculum. אנחנו גם לתאר נהלים קציר ועיבוד LDLNs והריאות לניתוח סחר אנטיגן על ידי cytometry הזרימה.
Protocol
1. לפני התהליך, להכין ולאסוף את הפריטים הבאים
- נא עיין התמונה באיור 1 א) ו - 1b) לבניית פלטפורמה מעץ לרסן את העכבר במהלך ההליך.
- עיכול לערבב עבור בלוטות הלימפה - HBSS + 1.25mg/ml collagenase TypeIV או 2.5 מ"ג / מ"ל collagenase D
- לערבב עיכול עבור ריאות - HBSS + 1 מ"ג / מ"ל collagenase
- מדולל חרוזים לטקס (01:20) ב-PBS להזרקה intraperitoneal לדמיין את LDLNs
הערה: LDLNs קטנים קשה למצוא. כדי ללמוד כיצד למצוא אותם, להזריק 200μl של 1:20 בדילול אדום חרוזי ניאון לטקס ה-IP לתוך העכבר. הצפק מנקז אלה LDLNs 8. 24 HPI, לחשוף את חלל בית החזה של העכבר כמתואר לעיל. LDLNs יהיה נראה ורוד מן החרוזים כי אזל חלל הצפק.
- תא דם אדום (RBC) הצפת תמוגה - 0.15M NH 4 Cl, 10mm KHCO 3, 0.1 mM Na 2 EDTA ב 1L DH 2 0. התאם את ה-pH 7.2-7.4 ולאחסן בטמפרטורת החדר.
- תא 70μm או 100μm מסננת
- במלאי פתרון של EDTA 0.5m, pH = 8.0
- HBSS ללא CaCl 2 ו - MgCl 2
- מספריים ובוטה, הסתיים מלקחיים
- ראי גרון
- Gavage (22 מד) מחט כפופות בזווית (איור 2)
- לוח קלקר וסיכות להפצת העכבר
- במחבת למעלה מאזן
- אנילין פתרון כחול - 10mg/ml ב H 2 O
הערה: אנחנו נהיה באמצעות פתרון זה עבור הפגנה של טכניקה אותה זריקה.
2. הכנה וניהול של העכבר הרדמה
- הכינו תערובת של Xylazine ו קטמין ב PBS סטרילי כך ריכוזי הסופי 2mg/ml ו 10mg/ml בהתאמה.
- לשקול את העכבר על האיזון מחבת בראש.
- לחשב את המינון הדרוש עכבר אחד. מנה ב Xylazine (2-4 מ"ג / ק"ג) ו קטמין (70-80 מ"ג / ק"ג) משקל הגוף באמצעות נפח מתאים של התערובת מוכן להזריק intaperitoneally. כל זן העכבר עשוי לדרוש אופטימיזציה של הרדמה. עכברים שקיבלו יותר מדי חומר הרדמה עלולה להיות קצב הנשימה מופחתת שעלולה להיות קטלנית לאחר inoculum הוא החדירו לתוך הריאות.
- אחרי 3-5 דקות, לצפות את העכבר על ההשפעות של ההרדמה. בדוק את הסימנים הבאים כדי לוודא העכבר נמצא בהרדמה מלאה:
- קצב הנשימה צריך להאט.
- עכבר לא צריך למתוח את היד שלה, כאשר הרים בצוואר.
- לא צריך להיות שום תגובה כאשר הגפיים האחוריות הן מגורה.
אם הקריטריונים האלה אינם מתקיימים, לחכות כמה דקות ובדוק שוב לפני שתמשיך לשלב הבא.
3. Intratracheal הזרקה
- הכן את innoculum ב 50μl מלוחים. ממלאים מזרק 1ml מצויד במחט סטרילית gavage כפוף עם innoculum. המזרק צריך להיות טעון עם כיס אוויר 100μl מאחורי innoculum כדי לוודא שכל הנוזל הוא החדירו לתוך הריאה.
- הנח את העכבר על משטח העץ בזווית תלוי על החותכות שלו על החוט בעדינות לרסן אותו במקום עם חתיכת סרט.
- הפעל ראי גרון עם יד שמאל (אם אתם ימניים) לתפוס זוג מלקחיים הסתיים בוטה. השתמש קצה ראי גרון ואת מלקחיים כדי לחטט בעדינות לפתוח את הפה.
- עם מלקחיים, להוציא את הלשון החוצה להחזיק אותו בצד. מדריך להב ראי גרון לעבר הצד האחורי של הפה. שמור את ראי גרון לחצה מטה בעדינות בזווית של 90 מעלות עד שתראה את הפתיחה של קנה הנשימה. החזק את ראי גרון במקום. יש להקפיד כאשר מושכים את הלשון מן הפה ואת זה צריך להיעשות בעדינות כדי לא פוגע ברקמת מתרחשת.
- עם היד השנייה, לקחת את המזרק 1ml המכיל את innoculum, מצויד המחט gavage כפוף עם יד ימין שלך להכניס את המחט לתוך קנה הנשימה עד לכופף את המחט היא על ידי החותכות הקדמיות. דחוף את הבוכנה שווה להעביר את innoculum. Innoculum צריך לא בועה. משוך את המחט מתוך קנה הנשימה בהקדם האפשרי. עכברים לא להיחנק ולמות אם קנה הנשימה חסום במשך זמן רב מדי. החזק את העכבר זקוף לכמה שניות כדי לאפשר innoculum להיות בשאיפה לריאות.
- קח את העכבר מתוך פלטפורמת ולמקם אותו ליד מנורת חימום. אל תשאיר עכברים תחת חום ישיר לפרקי זמן ממושכים. העכבר צריך להיות ער לחלוטין בתוך 30 דקות לאחר ההליך (זמן ההחלמה עשוי להשתנות בהתאם זנים). עכברים יש לשים לב בחריצות בזמן הזה אסור לקבל חם מדי או קר מדי, זה יכול גם לשים את העכברים לתוך מצוקה נשימתית המובילה למוות.
4. קציר ועיבוד ניקוז בלוטות לימפה ריאות והריאות עבור cytometry זרימה
- הקורבן עכברים בשיטה הרצויה לפי הנחיות האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית המתת חסד. זה עשוי להשתנות בהתאם לתוצאות הבציר בודדים. מינהל קטלני עושה של נתרן pentobarbital הוא דוגמה הליך המתת חסד המתאים. לא ראינו השפעות שליליות ריאתי של המתת חסד על ידי ה-CO 2.
- הצמד את הידיים והרגליים על לוח לנתיחה. עושים חתך לאורך אמצע בצד הגחון במספריים. משוך בעדינות את העור ולחשוף את שרירי קיר בית החזה.
- ודא חתכים דרך שרירי קיר בית החזה כדי לחשוף את אברי הבטן.
- החזק את קצה עצם החזה עם מלקחיים לנקב את הסרעפת. חותכים את הסרעפת בצדי כלוב הצלעות.
- עם מספריים במקביל פני הלוח לנתיחה, חתך דרך חלל החזה לאורך קו dorso-הגחון משני הצדדים.
- מעט להרים את החזה למעלה. בצד ימין של הלב, ממש מתחת התימוס, לחפש שני בלוטות הלימפה. הצומת לימפה מעט גדול השלישי נמצא מתחת כלי דם קטנים עורקי העובר בניצב לקנה הנשימה. בלוטות הלימפה קציר לתוך 1 מ"ל של תערובת הלימפה העיכול.
- לאחר קצירת בלוטות הלימפה, החזק את הלב עם זוג מלקחיים לתפוס את הריאות עם אחר. קציר לתוך הריאות 3ml קרח קר PBS בצלחת 6 באר.
- הפרד את האונות של הריאות, לשאוב PBS וקוצצים האונות לחתיכות קטנות בעזרת מלקחיים ומספריים. הוסף 3ml של תמהיל לעיכול עבור הריאות. שמור את צלחת 6-היטב על הקרח במהלך שלב זה.
- דגירה בלוטות הלימפה עבור 25-30 דקות והריאות למשך 30 דקות ב 37 ° C. הוסף EDTA לריכוז סופי של 10mm לכל אחד תערובות העיכול כדי לעצור את התגובה ומניחים על קרח.
- באמצעות מזרק 3ml, להעביר פיסות של הריאות באמצעות מחט 18GA 3 פעמים. מועכים את חתיכות של הריאות ואת LNs באמצעות 70-100μm strainers התא בעזרת הקצה האחורי של הבוכנה מזרק 1ml. שטפו את strainers תא עם 10 מ"ל של HBSS ללא Ca 2 + ו - Mg 2 +. צנטריפוגה XG ב 500 דקות 5.
- Resuspend גלולה ב 5 מ"ל של חיץ תמוגה RBC ו דגירה 3 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף 10 מ"ל של HBSS ללא Ca 2 + ו - Mg 2 + להרוות תמוגה. צנטריפוגה XG ב 500 דקות 5. תביא את הריאות השעיות LDLN תא בודד כדי 10 מ"ל ו 5 מ"ל בהתאמה. ספירת תאים חיים באמצעות hemacytometer על ידי הרחקה trypan כחול. תאים מוכנים כעת כתם עבור cytometry הזרימה. 1 אונה של הריאה יכול להיות מספיק עבור cytometry הזרימה. האונות אחרים יכולים לשמש שאלות ניסיוניות אחרים בתוך העכבר באותו כגון homogenates עבור ציטוקינים או רקמה היסטולוגיה.
5. נציג תוצאות:
LDCs ומקרופגים מכתשיים בריאות לרכוש אנטיגן מן החללים מכתשיים של הריאות מיד לאחר אותה זריקה. איור 3 מראה אחוז CD11c + (ביטא על LDCs ומקרופגים מכתשיים) בתאים חיוביים נבגים anthracis Bacillus שכותרתו fluorescently, שלאחר 30 דקות זה הזרקה. בשלב זה, ~ 15.9% של CD45 + + CD11c תאים ההשעיה תא בודד ריאות טיפח anthracis Bacillus נבגים (איור 3, לוחות נמוך יותר). לאפיון נוסף של תאים CD11c + בריאות, עיין קים Braciale 4. חרוזים שכותרתו fluorescently משמשים באופן שגרתי כדי להעריך את הסחר של אנטיגנים חלקיקים כדי LDLNs 9. כדי להעריך את התחבורה מהריאות אל LDLNs, פלורסנט חרוזים לטקס הוזרקו עם LPS ו LDLNs נותחו בבית HPI 24. כ -4% של תאים CD11c היי ב LDLNs טיפח חרוזי ניאון ב 24hpi (איור 4). ניסויים אלה מראים כי נציג בפרוטוקול זה ניתן להשתמש ביעילות כדי לעקוב אחר תאים לרכוש אנטיגנים חלקיקים בשאיפה לריאות, ולאחר מכן תנועה אותם LDLNs.
באיור 1. פלטפורמה מעץ עבור הרחקה עכברים במהלך ההזרקה זה. בלוק עץ נחתך בזווית מוטות מתכת הותאמו, מול נוף דמות 1a) ולהציג את הצד 1b דמות). פיסה קטנה של חוט נכרך סביב הבר מתכת לעגן את החותכות מול העכבר. חתיכה של סרט צורפה פלטפורמת לקשור סביב העכבר כדי לשמור אותו במקום במהלך ההליך.
איור 2. מחט להזרקה Gavage זה. Gavage מחט (מימין) היתה כפופה בזווית של ~ 135 ° (משמאל) להזרקה זה.
איור 3. אחוז של כל התאים + CD11c של הריאות כי הנמל הוא הזריק GFP להביע anthracis Bacillus (סטרן-p6GFP), אתגר הודעה 5hrs. עכברים AJ היו אתגר עם 1x10 8 GFP-Bacillus anthracis הנבגים והריאות נותחו על זיהום הודעה 5hrs. מגרשים נקודה להראות אחוז CD11c + לתאי ריאה, כי הם חיוביים anthracis Bacillus.
איור 4. זיהוי של חרוזים פלורסנט (צהוב / ירוק) בריאה ניקוז בלוטות הלימפה 24 שעות לאחר ההזרקה אני לא.. עכברים AJ ניתנו גם PBS (הפאנל השמאלי) או 5x10 9 Fluoresbrite microspheres י.ג. (0.5μm) עם 10μg LPS (פאנל מימין) זה LDLNs נותחו 24hpi. נציג מגרשים נקודה להראות אחוז התאים CD11c היי ב LDLNs כי חרוזים הנמל פלורסנט זממו נגד ערוץ ריקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו שימוש בפרוטוקול זה ללמוד הסחר של נבגים anthracis Bacillus מהריאות אל LDLNs. עבור יישומים דומים, מספר חלקיקים נמסר לריאות יש לבחור בקפידה כך שהחומר המוזרק ניתן להבחין LDLNs על ידי cytometry הזרימה. יש לנו גם השתמשו בהצלחה בשיטה זו להעברת המאמצת של תאים וסימון של אוכלוסיות תאים ספציפיים ריאות באמצעות נוגדנים שכותרתו fluorescently. בנוסף, שיטה זו משמשת באופן שגרתי לנהל bleomycin (א inducer הכימי של פיברוזיס ריאתי) ו ציטוקינים ישירות לתוך הריאות 10.
אמנם שיטה זו מאפשרת משלוח עקבית של חומרי הבדיקה לריאות, זה דורש הכשרה מקיפה ואימות (מושגת על ידי החדרת צבע לריאות). שיטה זו אולי לא את הרלוונטיות פיזיולוגיים כמו מסלולים אחרים של שאיפה כי היא אינה כוללת את דרכי הנשימה העליונות שבו אינטראקציות חשובות המערכת החיסונית יכול להיות יזם. עם זאת, עדיף שבו הפרשנות יכול להיות מסובך ידי ספיגת של הסוכן מנוהל על ידי בלוטות לימפה אזוריות הראש והצוואר ועל ידי גירוי של אפיתל בדרכי הנשימה. כמו עם כל הדגמים, גורמים ניסיוניים כגון מינון, רכב למסירה, הפצה של החומר המוזרק, נזק אפיתל הנשימה ואת ההשפעות של ההרדמה צריכים להיחשב בזמן תכנון ניסויים. בהשוואה לנהלים קונבנציונאלי עבור החדרה זה, אנו מאמינים כי שיטה זו מפחיתה באופן משמעותי הנזק אפיתל בדרכי הנשימה. עם זאת, בקבוצת הביקורת המתאים יש להשתמש כדי להסביר את הפגיעה מאז נזק באתר של חיסון עלול להשפיע על האספקה של אנטיגנים אל קשרי הלימפה 11. אנו ממליצים להשתמש מלוחים ככלי אך אם חומר הבדיקה מחייבת מדיה ספציפית עבור יעילות, פקדי הרכב לא צריך להיות מוזנח. הפצה של חומר חלקיקי מוזרק האונות שונים של הריאות יכול להיות פרמטר חשוב עבור ניסויים מסוימים. במקרים כאלה, כל אחת האונות ניתן לנתח בנפרד מיד לאחר אותה זריקה. הפצה של חומרים שונים אל תוך האונות של הריאות הבאה זה המסלול של החדרה תוארה על ידי קוסטה ואח' 12.
אנו מתמקדים בניתוח שלנו על בלוטות הלימפה ניקוז המתוארות לעיל אשר נגישים בסוג פרוע ביותר לדפוק את זנים של עכברים המשמשים במעבדות שלנו. עם זאת, ישנם נוסף ניקוז בלוטות לימפה באזור החזה 13,14 שעשוי גם להיות מנותח. אם בלוטות הלימפה יותר רצוי ניסוי, אנו ממליצים זיהוי ראשוני באמצעות הזרקה ip של חרוזי ניאון כמפורט בפרוטוקול. שתי בלוטות הלימפה כי אנו ממליצים על ניתוח נמצאים בסמיכות התימוס ולכן יש להיזהר במהלך החילוץ.
כאמור, שיטה זו ניתן להתאים לחשוף הריאות למגוון זיהומיות אורגניזמים, אלרגנים או רעלים. הוא מספק אלטרנטיבה פשוטה ועקבית מסלולים קונבנציונליים החשיפה משאיפת ולא כולל את דרכי הנשימה העליונות. זה שימושי במיוחד עבור ניסויים המתמקדים באירועים ליזום את הריאות ריאה בלוטות הלימפה לנקז לפני אתר אחר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell stariner | BD Biosciences | ||
| Aniline Blue | Fisher Scientific | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington Biochemical | ||
| Collagenase D | Roche Group | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc. | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc. | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | Welch Allyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd, Inc. |
References
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).
- Bar-Haim, E. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).
- Kim, T. S., Braciale, T. J. Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses. PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).
- Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity. J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).
- Thomas, R. J. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. J Med Microbiol. , (2010).
- Kiyono, H., Fukuyama, S. NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).
- Parungo, C. P. Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics. Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).
- Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen. J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).
- Higgins, D. M. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).
- Kool, M. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J Exp Med. 205, 869-869 (2008).
- Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope. Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).
- Takahashi, S., Patrick, G. Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat. Lab Anim. 21, 31-31 (1987).
- Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).
