غير الجراحية التقطير داخل الرغامى من الفئران مع تحليل الرئتين والعقد الليمفاوية والرئة التي تصريف التدفق الخلوي

Summary

نحن لتوضيح غير الجراحية تسليم مواد الاختبار في الرئتين من الفئران تخدير عن طريق القصبة الهوائية. هذا الأسلوب يسمح الرئة التعرض لمسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية ، السيتوكينات ، والأجسام المضادة ، والخرز ، والمواد الكيميائية ، أو الأصباغ. ونحن كذلك وصف حصاد وتجهيز الرئتين والعقد اللمفاوية استنزاف الرئة (LDLNs) لالتدفق الخلوي.

Abstract

الخلايا البلعمية السنخية مثل الضامة ، والخلايا الجذعية الرئة (أقل البلدان نموا) عينة من مولدات المضادات باستمرار المسافات السنخية في الرئتين. أقل البلدان نموا ، على وجه الخصوص ، ومن المعروف أن تهاجر إلى العقد اللمفية استنزاف الرئة (LDLNs) حيث يقدمون مستضدات استنشاقها لخلايا T المبادرة استجابة مناسبة في مأمن من مجموعة متنوعة من immunogens ^1،2. لنموذج التفاعلات بين الرئتين ومولدات المضادات الجوية في الفئران ، ويمكن أن تدار الأنف مستضدات ^1،3،4 ، intratracheally ⁵ أو ⁶ كما الهباء. تسليم كل مسار ينطوي على مهارات فنية متميزة والقيود التي يجب النظر فيها قبل تصميم التجربة. على سبيل المثال ، والتعرض للرذاذ الأنف والرئتين لمستضدات يسلم على حد سواء ، والجهاز التنفسي العلوي. وبالتالي يمكن الوصول إلى مستضدات الأنسجة اللمفاوية المرتبطة الأنف (NALT) ⁷ ، تعقيد يحتمل تفسير النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، قد البلع ، والعطس ومعدل التنفس من الفأرة يؤدي أيضا إلى عدم الاتساق في جرعات تسليمها. رغم أنه قد يكون من المفضل اشتراك في الجهاز التنفسي العلوي لبعض الدراسات والتجارب التي يمكن أن تعقد مع التركيز على الأحداث بدأت تحديدا في الرئتين. في هذا الإعداد ، داخل الرغامى (عليه) هو الطريق الأفضل لأنها توفر مواد الاختبار مباشرة إلى الرئتين ويتجاوز NALT. العديد من بروتوكولات الحقن أنها تنطوي على التنبيب إما أعمى من القصبة الهوائية من خلال تجويف الفم أو التعرض الجراحية من القصبة الهوائية للوصول إلى الرئتين. هنا ، نحن تصف ، بما يتفق بسيطة وغير الجراحية لأنها طريقة تقطير. هو تصور فتح القصبة الهوائية باستخدام المنظار ، ويتم بعد ذلك إدخال إبرة عازمة بالتزقيم مباشرة في القصبة الهوائية للتربة من تسليم. وصفنا أيضا إجراءات للحصاد وتجهيز LDLNs والرئتين لتحليل الاتجار المستضد بواسطة التدفق الخلوي.

Protocol

1. قبل العملية ، وإعداد وجمع المواد التالية

1. يرجى الرجوع إلى الصورة في الشكل 1A) و 1b) لبناء منصة خشبية لكبح جماح الماوس أثناء العملية.
2. مزيج الهضم لالغدد الليمفاوية -- HBSS + 1.25mg/ml كولاجيناز TypeIV أو 2.5 ملغ / مل D كولاجيناز
3. مزيج الهضم عن الرئتين -- HBSS + 1 ملغ / مل كولاجيناز
4. تمييع الخرز اللاتكس (1:20) في برنامج تلفزيوني للحقن داخل الصفاق لتصور LDLNs

ملاحظة : LDLNs صغيرة ويصعب العثور عليها. لمعرفة كيفية العثور عليها ، وضخ 200μl من الخرز الأحمر المخفف 01:20 اللاتكس الفلورسنت الملكية الفكرية في الماوس. البريتوني لهذه المصارف LDLNs ^8. 24 HPI ، كشف التجويف الصدري من الفأرة كما هو موضح أعلاه. سوف يظهر LDLNs الوردي من الخرز التي استنزفت من التجويف البريتوني.

5. خلايا الدم الحمراء (RBC) تحلل العازلة -- 0.15M NH ₄ CL ، 10MM KHCO ₃ ، 0.1 ملم نا ₂ EDTA في DH 1L ₂ 0. ضبط الرقم الهيدروجيني ل7،2-7،4 وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
6. 70μm 100μm الخلية أو مصفاة
7. حل سهم 0.5M EDTA ، ودرجة الحموضة = 8.0
8. HBSS دون CaCl ₂ و ₂ MgCl
9. مقص وملقط كليلة العضوية
10. منظار الحنجرة
11. بالتزقيم الإبرة (22 مقياس) عازمة على زاوية (الشكل 2)
12. الستايروفوم مجلس ودبابيس لنشر الماوس
13. أعلى عموم التوازن
14. النيلين الأزرق الحل -- 10mg/ml في H ₂ O

ملاحظة : سوف يتم استخدام هذا الحل لإثبات أن تقنية الحقن.

2. إعداد وإدارة مخدر الماوس

1. تحضير مزيج من زيلازين والكيتامين في برنامج تلفزيوني العقيمة بحيث تركيزات النهائية 2mg/ml و10mg/ml على التوالي.
2. وزن الماوس على التوازن القومي الأعلى.
3. حساب الجرعة المطلوبة لكل الماوس. الجرعة زيلازين (2-4 ملغم / كغم) والكيتامين (70-80 مغ / كغ) من وزن الجسم باستخدام حجم المناسبة من الخليط ومستعدة لضخ intaperitoneally. يجوز لكل سلالة الفأر تتطلب التحسين من التخدير. الفئران قد تلقى الكثير من مخدر يكون خفض معدل التنفس يمكن أن تكون قاتلة بعد غرست قيحة إلى الرئتين.
4. بعد 3-5 دقائق ، ومراقبة الماوس للآثار مخدر. التحقق من العلامات التالية للتأكد من أن الفأر هو تخدير الكامل :
   1. وينبغي أن معدل التنفس إبطاء.
   2. وينبغي أن لا تمتد الماوس ذراعها عندما التقطت من الرقبة.
   3. ينبغي ألا يكون هناك أي رد فعل عندما يتم تحفيز أطرافه الخلفية.
      إذا لم يتم استيفاء هذه المعايير ، والانتظار لبضع دقائق والاختيار مرة أخرى قبل الانتقال الى الخطوة التالية.

3. الحقن داخل الرغامى

1. إعداد تربة من المياه المالحة في 50μl. حقنة ملء 1ml مزودة بإبرة معقمة عازمة بالتزقيم مع تربة من. يجب أن يتم تحميل المحقنة مع جيب هوائي 100μl تربة من وراء لضمان غرس كل من السوائل في الرئة.
2. ضع الماوس على منصة خشبية مائلة شنقا القواطع على السلك وكبح جماح برفق في مكان مع قطعة من الشريط.
3. بدوره على المنظار مع يدك اليسرى (إذا كنت الحق وسلم) والاستيلاء على زوج من كليلة ملقط انتهت. استخدام غيض من المنظار وملقط ونقب بلطف لفتح الفم.
4. مع ملقط ، وسحب اللسان بها والاحتفاظ بها إلى الجانب. دليل النصل المنظار نحو الجزء الخلفي من الفم. إبقاء الضغط على المنظار برفق جدا بزاوية 90 درجة حتى تشاهد افتتاح القصبة الهوائية. عقد المنظار في المكان. يجب توخي الحذر عند سحب اللسان من الفم ، وينبغي أن يتم ذلك برفق حتى لا تحدث أضرار الأنسجة.
5. بيدك الأخرى ، وأخذ حقنة تحتوي على تربة من 1ml ، مزودة إبرة بالتزقيم عازمة بيديك الحق وادخال الإبرة في القصبة الهوائية حتى ينحني في الإبرة من القواطع الأمامية. دفع المكبس بالتساوي على تربة من تسليم. لا ينبغي للتربة من الفقاعة. سحب الإبرة من القصبة الهوائية في أقرب وقت ممكن. سوف تختنق وتموت الفئران إذا تم حظر القصبة الهوائية لفترة طويلة جدا. عقد الماوس تستقيم لبضع ثوان للسماح تربة من استنشاق في الرئتين.
6. أخذ الفأر من منصة وضعها قرب مصباح التدفئة. لا تترك الفئران تحت الحرارة المباشرة لفترات طويلة من الزمن. ينبغي أن تكون مستيقظا الماوس بالكامل في غضون 30 دقيقة بعد العملية (الوقت الانتعاش قد تختلف استنادا إلى سلالات). ينبغي التقيد الفئران بجد خلال هذا الوقت وينبغي ألا يسمح للحصول على الساخنة جدا أو الباردة جدا ، وهذا يمكن أيضا وضع الفئران إلى ضيق في التنفس يؤدي إلى الموت.

4. الحصاد وتجهيز العقد الليمفاوية والرئة والرئتين لتجفيف التدفق الخلوي

1. التضحية الفئران باستخدام الأسلوب المطلوب وفقا لاخر احصاء المبادئ التوجيهية القتل الرحيم. هذا قد تختلف تبعا لنتائج الحصاد الفردية. إدارة قاتلة من الصوديوم لا بنتوباربيتال هو مثال إجراء القتل الرحيم المناسبة. لم نر تأثيرات سلبية على القتل الرحيم الرئوي بواسطة CO _2.
2. دبوس الذراعين والساقين على لوحة التشريح. إجراء شق على طول المناطق الوسطى من الجانب البطني مع المقص. برفق الجلد وتعريض عضلات جدار الصدر.
3. جعل شقوق من خلال عضلات جدار الصدر للكشف عن الأجهزة في البطن.
4. عقد قمة للقص مع ملقط وثقب في الحجاب الحاجز. قطع الحجاب الحاجز على طول جانبي القفص الصدري.
5. مع مقص موازية لتشريح سطح اللوحة ، وقطع طريق التجويف الصدري على طول خط ظهراني البطنية على كلا الجانبين.
6. رفع طفيف ليصل القفص الصدري. على الجانب الأيمن من القلب ، تماما تحت التوتة ، والبحث عن الغدد الليمفاوية اثنين. ويقع أكبر قليلا العقدة الليمفاوية تحت third سفينة الدم في الشرايين الصغيرة التي تدير عمودي على القصبة الهوائية. الغدد الليمفاوية الحصاد في 1 مل من مزيج العقدة الليمفاوية الهضم.
7. بعد الحصاد في الغدد الليمفاوية ، وعقد القلب مع زوج من الملقط والاستيلاء على الرئتين مع آخر. الحصاد في الرئتين 3ml من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في لوحة 6 - جيدا.
8. فصل فصوص من الرئتين ، ونضح PBS ويقطع الى قطع صغيرة فصوص باستخدام ملقط ومقص. إضافة 3ml من مزيج الهضم عن الرئتين. الحفاظ على لوحة 6 - جيدا على الجليد خلال هذه الخطوة.
9. احتضان الغدد الليمفاوية لمدة 25-30 دقيقة والرئتين لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة إلى تركيز EDTA النهائي 10mm إلى كل من الخلائط الهضم لوقف رد الفعل ومكان على الجليد.
10. استخدام حقنة 3ml ، تمرير قطعة من الرئتين عن طريق إبرة 18GA 3 مرات. الهريس قطعة من الرئتين وLNS من خلال مصافى الخلية 70 100μm به نهاية الخلفي من المكبس المحاقن 1ml. غسل مصافى زنزانة مع 10ML من دون HBSS كا ^{2 + 2 +} والمغنيسيوم. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق.
11. Resuspend الكرية في 5 مل من تحلل RBC العازلة واحتضان لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 10ML من دون HBSS كا ^{2 + 2 +} والمغنيسيوم لإرواء تحلل. أجهزة الطرد المركزي في 500 XG لمدة 5 دقائق. إحضار الرئة والايقاف LDLN خلية واحدة إلى و10ML 5ml على التوالي. عد الخلايا الحية باستخدام عدادة الكريات بالاستبعاد التريبان الأزرق. الخلايا هي الآن على استعداد لصمة عار عن التدفق الخلوي. 1 قد الفص في الرئة تكون كافية لالتدفق الخلوي. ويمكن استخدام فصوص أخرى للأسئلة تجريبية أخرى داخل الماوس نفسه مثل الخليط عن السيتوكينات أو أنسجة لعلم الأنسجة.

5. ممثل النتائج :

أقل البلدان نموا والبلاعم السنخية في الرئتين من الحصول على مستضد المسافات السنخية في الرئتين بعد ذلك على الفور الحقن. ويبين الشكل 3 النسبة المئوية للCD11c + (على أقل البلدان نموا وأعرب البلاعم السنخية) الخلايا التي هي ايجابية للfluorescently المسمى عصيات الجمرة الخبيثة ، بعد 30 دقيقة كان الحقن. في هذا الوقت ، آوى ~ 15.9 ٪ من الخلايا CD45 + + CD11c في خلية واحدة تعليق الرئة أبواغ عصيات الجمرة الخبيثة (الشكل 3 ، وانخفاض لوحات). لتوصيف مزيد من الخلايا + CD11c في الرئتين ، وتشير إلى كيم وBraciale ^4. وتستخدم بشكل روتيني الخرز fluorescently المسمى لتقييم الاتجار مستضدات الجسيمات إلى LDLNs ^9. لتقييم هذا النقل من الرئتين إلى LDLNs وحقن اللاتكس الفلورسنت الخرز مع LPS LDLNs وحللت في 24 HPI. تؤوي حوالي 4 ٪ من الخلايا ^مرحبا CD11c في LDLNs الخرز الفلورسنت 24hpi في (الشكل 4). هذه التجارب تبين أن ممثل هذا البروتوكول يمكن استخدامها بكفاءة لتتبع الخلايا التي تحصل على مولدات المضادات الجسيمات المستنشقة في الرئتين والاتجار بهم إلى وقت لاحق LDLNs.

الشكل 1. منصة خشبية لكبح الفئران خلالها الحقن. انقطع كتلة خشبية في زاوية وتم تركيب قضبان معدنية ، أمام الرأي الشكل 1A) و 1b الجانب الرقم عرض). وكان الجرح قطعة صغيرة من سلك حول قضيب معدني لترسيخ القواطع الأمامية من الفأرة. وعلقت قطعة من الشريط إلى منصة لربط جميع أنحاء الماوس لابقائه في مكانه أثناء العملية.

الشكل 2. عازمة إبرة بالتزقيم له الحقن. إبرة بالتزقيم (يمين) بزاوية 135 درجة ~ (يسار) لأنها الحقن.

الشكل 3. النسبة المئوية لجميع خلايا + CD11c في الرئتين التي تؤوي انها GFP حقن معربا عن عصيات الجمرة الخبيثة (نجوم ، p6GFP) ، 5hrs تحديا آخر. وكانت الفئران AJ التحدي مع 1Xوقد تم تحليل 10 ⁸ جراثيم الجمرة الخبيثة GFP - العصوية والرئتين في آخر 5hrs العدوى. المؤامرات تظهر نقطة مئوية من CD11c + خلايا الرئة التي هي ايجابية لعصيات الجمرة الخبيثة.

الشكل 4. الكشف عن حبات فلوري (الأصفر / الأخضر) في الرئة تجفيف الغدد الليمفاوية 24 ساعة بعد الحقن ر ط. أعطيت الفئران AJ إما PBS (اللوحة اليسرى) أو 5x10 ⁹ المجهرية Fluoresbrite YG (0.5μm) مع 10μg LPS (اللوحة اليمنى) وتحليلها وLDLNs 24hpi. ممثل المؤامرات نقطة مئوية تظهر الخلايا ^مرحبا CD11c في LDLNs الخرز الميناء الفلوري الذي يحاك ضد قناة فارغة.

Discussion

وقد استخدمت ونحن على هذا البروتوكول لدراسة الاتجار من عصيات الجمرة الخبيثة من الرئتين إلى LDLNs. لتطبيقات مماثلة ، يجب أن يكون عدد جزيئات تسليمها الى الرئتين يتم اختيارها بعناية بحيث يمكن الكشف عن مواد تحقن في LDLNs بواسطة التدفق الخلوي. لدينا أيضا استخدمت بنجاح هذه الطريقة لنقل بالتبني من الخلايا ووضع العلامات المحددة لسكان الخلية الرئة باستخدام الأجسام المضادة fluorescently المسمى. بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم هذا الأسلوب عادة لإدارة بليوميسين (أ محفز الكيميائية التليف الرئوي) والسيتوكينات مباشرة إلى الرئتين ^10.

على الرغم من أن هذا الأسلوب يسمح تسليم ثابت من مواد الاختبار في الرئتين ، وأنها تتطلب تدريبا مكثفا والتحقق (التي حققها غرس صبغة في الرئتين). هذا الأسلوب قد لا يكون بنفس الأهمية الفسيولوجية وطرق أخرى من استنشاق لأنه يستثني الجهاز التنفسي العلوي ، حيث لا يجوز الشروع في التفاعلات الهامة والاستجابات المناعية. ومع ذلك ، فمن الأفضل أن يكون معقدا حيث يمكن تفسير الإقبال على وكيل التي يديرها الغدد الليمفاوية الإقليمية في الرأس والرقبة والتحفيز للظهارة الجهاز التنفسي. كما هو الحال مع جميع النماذج ، ينبغي أن جميع العوامل التجريبية مثل جرعة وسيلة لإيصال وتوزيع المواد حقن ، وتلف ظهارة التنفسية وآثار التخدير بينما يعتبر تصميم التجارب. مقارنة للإجراءات التقليدية لأنها تقطير ، ونحن نعتقد أن هذا الأسلوب يقلل بشكل ملحوظ الأضرار التي لحقت ظهارة المسالك التنفسية. قد ومع ذلك ، ينبغي أن تستخدم جماعات مراقبة ملائمة لحصر الأضرار منذ اصابة في موقع التلقيح يؤثر على أداء المستضدات إلى الغدد الليمفاوية ^11. ونحن نوصي باستخدام المياه المالحة وسيلة ولكن إذا كان يتطلب وسائل الاعلام مواد الاختبار المحددة للفعالية ، يجب عدم إهمال الضوابط تكون مركبة. قد توزيع المواد الجسيمية حقنها في فصوص مختلفة من الرئتين يكون معيارا هاما لتجارب معينة. في مثل هذه الحالات ، يمكن تحليل كل من الفصوص بشكل منفصل بعد ذلك على الفور الحقن. وقد وصفت توزيع المواد في مختلف فصوص من الرئتين بعد ذلك مسار تقطير بواسطة كوستا وآخرون ^12.

ونحن نركز تحليلنا على العقد اللمفية استنزاف المذكورة أعلاه والتي يمكن الحصول عليها في النوع الأكثر البرية وضرب سلالات من الفئران المستخدمة في مختبراتنا. ومع ذلك ، هناك إضافية تجفيف الغدد الليمفاوية في منطقة الصدر ^13،14 أنه يمكن أيضا أن تحلل. إذا كان العقد الليمفاوية أكثر من المرغوب فيه للتجربة ، نوصي باستخدام الحقن الأولي تحديد الملكية الفكرية من الخرز الفلورسنت كما هو موضح في البروتوكول. اثنين من الغدد الليمفاوية التي نوصي بها لتحليلها وعلى مقربة من الغدة الصعترية لذا ينبغي الحرص أثناء الاستخراج.

كما ذكر سابقا ، يمكن تكييف هذه الطريقة للكشف عن الرئتين لمجموعة متنوعة من المواد المثيرة للحساسية المعدية والكائنات الحية أو السموم. أنها توفر بديلا بسيطة ومتسقة لطرق التقليدية للاستنشاق ويستبعد الجهاز التنفسي العلوي. انها مفيدة بشكل خاص للتجارب التي تركز على الأحداث التي تبدأ في الرئتين والعقد اللمفاوية استنزاف الرئة قبل أي موقع آخر.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
70μm Cell stariner	BD Biosciences
Aniline Blue	Fisher Scientific	A967-25
Animal Feeding needle	Popper & Sons, Inc.	7920
Collagenase	Sigma-Aldrich	C2139
Collagenase TypeIV	Worthington Biochemical
Collagenase D	Roche Group	11088974103
DPBS	Invitrogen	14190
Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm)	Polysciences, Inc.	17152
HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride	Invitrogen	14170
Ketamine HCl (100mg/ml)	Hospira Inc.
Laryngoscope Blade	PennCentury, Inc	For Model LS-1	Refer to www.penncentury.com
Lightweight Fiber Optic Laryngoscope	Welch Allyn	80814
Red Fluorescent Beads (0.5μm)	Invitrogen	F8812	For i.p injection
Xylazine (100mg/ml)	Lloyd, Inc.