Summary
Проиллюстрируем нехирургических доставки тестовых материалов в легких мышей под наркозом через трахею. Этот метод позволяет легкого воздействия бактериальных и вирусных патогенов, цитокины, антитела, бусы, химических веществ или красителей. Мы также описать уборки и обработки легких и легких дренаж лимфатических узлов (LDLNs) для проточной цитометрии.
Abstract
Фагоцитирующих клеток, таких как альвеолярные макрофаги и дендритные клетки легких (НРС) непрерывно образец антигенов из альвеолярного пространства в легких. НРС, в частности, как известно, мигрируют в легкие дренаж лимфатических узлов (LDLNs), где они представляют вдыхании антигенов Т-клеткам начать соответствующие иммунного ответа на различные иммуногенов 1,2. Для моделирования взаимодействия между легкими и воздушными антигены у мышей, антигены можно вводить интраназально 1,3,4, интратрахеально 5 или 6 в виде аэрозолей. Доставка каждый маршрут включает в себя различные технические навыки и ограничения, которые должны быть рассмотрены до проектирования эксперимента. Например, интраназального и аэрозольного воздействия антигенов обеспечивает как легких и верхних дыхательных путей. Следовательно антигенов можете получить доступ к носовой лимфоидной ткани (NALT) 7, потенциально осложняет интерпретацию результатов. Кроме того, глотание, чихание и дыхание скорость мыши также могут привести к противоречиям в дозах доставлено. Хотя участие верхних дыхательных путей может быть предпочтительным для некоторых исследований, она может усложнять эксперименты упором на события специально начата в легкие. В этих условиях интратрахеального (она) маршрут предпочтительнее, так как она обеспечивает испытания материалов непосредственно в легкие и обходит NALT. Многие ее протоколов инъекции потребовать либо слепое интубации трахеи через ротовую полость или хирургического воздействия трахеи для доступа легких. Здесь мы опишем простым, последовательным, нехирургических методов для него инстилляции. Открытие трахеи визуализируется использованием ларингоскопа и изогнутые иглы зонда затем вставляется непосредственно в трахею, чтобы доставить innoculum. Мы также описываем процедуры сбора и переработки LDLNs и легкие для анализа антиген торговли с помощью проточной цитометрии.
Protocol
1. Прежде чем процесс, подготовить и собрать следующие пункты
- Пожалуйста, обратитесь к изображению на рисунке 1а) и 1б) для строительства деревянной платформе сдерживать мыши во время процедуры.
- Пищеварение смесь для лимфатических узлов - HBSS + 1.25mg/ml Коллагеназа TypeIV или 2,5 мг / мл коллагеназы D
- Пищеварение смеси для легких - HBSS + 1 мг / мл коллагеназы
- Развести латексных шариков (1:20) в PBS для внутрибрюшинного введения визуализировать LDLNs
Примечание: LDLNs малы и трудно найти. Чтобы узнать, как найти их, вводят 200 мкл разбавленного 1:20 красный флуоресцентный бисером латекса ф в мышь. Брюшины стоков в эти LDLNs 8. 24 HPI, подвергать грудной полости мыши, как описано выше. LDLNs появится розовая из бисера, что изъятые из брюшной полости.
- Красные кровяные клетки (эритроциты) Лизис буфер - 0,15 М NH 4 Cl, 10 мМ KHCO 3, 0,1 мМ Na 2 EDTA в 1L дН 2 0. Отрегулируйте рН до 7,2-7,4 и хранят при комнатной температуре.
- 70μm или 100 мкм ячейки фильтра
- Маточный раствор 0,5 М ЭДТА, рН = 8,0
- HBSS без CaCl 2 и MgCl 2
- Ножницы и тупыми концами пинцета
- Ларингоскоп
- Желудочный зонд иглы (22 калибра) изогнута под углом (рис. 2)
- Пенополистирол борту и булавки для распространения мыши
- Топ чашку весов
- Анилин синий раствор - 10mg/ml в H 2 O
Примечание: Мы будем использовать это решение для демонстрации его инъекции техники.
2. Подготовка и управление мышью анестезии
- Приготовить смесь из Ксилазин и кетамин в стерильном PBS, так что окончательные концентрации 2mg/ml и 10mg/ml соответственно.
- Взвесьте мыши на верхнюю чашку весов.
- Рассчитайте дозы, необходимой для каждой мыши. Доза в Ксилазин (2-4 мг / кг) и кетамин (70-80 мг / кг) массы тела с использованием соответствующих объемов приготовленной смеси и ввести intaperitoneally. Каждая мышь напряжение может потребовать оптимизации анестезии. Мышей, получавших слишком много анестезии, возможно, снижается частота дыхания, что может оказаться фатальным после посевной закапывают в легкие.
- Через 3-5 минуты, наблюдать мышь для воздействия анестетика. Проверьте следующие признаки, чтобы подтвердить, что мышь полностью под наркозом:
- Темп дыхания должен замедляться.
- Мышь не должна растягиваться его руку, когда взял за шею.
- Там не должно быть какого-либо ответа, когда задние конечности стимулируются.
Если эти критерии не выполняются, подождите несколько минут и проверьте еще раз, прежде чем переходить к следующему шагу.
3. Интратрахеального инъекции
- Подготовка innoculum в 50 мкл физиологического раствора. Заполните шприц 1мл оснащен стерильной иглой зонд изогнутый с innoculum. Шприц должен быть загружен с 100 мкл карман воздуха за innoculum чтобы все жидкость закапывать в легких.
- Место мыши на угловые деревянной платформе висит на его резцов на провода и аккуратно удерживать его на месте с кусок ленты.
- Включите ларингоскоп левой рукой (если вы правша) и захватить пару тупыми концами пинцета. Используйте кончик ларингоскоп и пинцетом аккуратно приподнимите открытым ртом.
- С щипцов, вытащить язык, и удерживать ее в сторону. Руководство ларингоскоп лезвия к задней части рта. Держите нажатой ларингоскоп очень мягко на угол 90 °, пока не увидите открытие трахеи. Держите ларингоскоп на месте. Следует проявлять осторожность при извлечении язык изо рта, и это должно быть сделано аккуратно, чтобы не ткань убытков происходит.
- Другой рукой, возьмите 1 мл шприц, содержащий innoculum, оснащенный изогнутые иглы зонда с вашей правой руки и вставить иглу в трахею до изгиба иглы от передних резцов. Надавите на поршень равномерно поставлять innoculum. Innoculum не должны пузырь. Вытащите иглу из трахеи как можно скорее. Мыши будут задыхаться и умирать, если трахея блокируется слишком долго. Держите мышь вертикально в течение нескольких секунд, чтобы позволить innoculum вдохнуть в легкие.
- Возьмите мышь из платформы и поместить его рядом с нагревательными лампы. Не оставляйте мышей под прямым тепла в течение длительных периодов времени. Мышь должна быть окончательно проснулся через 30 мин после процедуры (время восстановления может меняться в зависимости от штамма). Мыши должны быть соблюдены старательно в это время и не следует допускать, чтобы получить слишком жарко или слишком холодно, то это может также поместить мышей в дыхательная недостаточность приводит к смерти.
4. Заготовка и переработка легких осушение лимфатические узлы и легкие для проточной цитометрии
- Жертва мышах желаемый метод в соответствии с руководящими принципами AVMA эвтаназии. Это может варьироваться в зависимости от индивидуальных результатов сбора урожая. Администрация смертельной делает натрия фенобарбитала является примером соответствующую процедуру эвтаназии. Мы не видели отрицательные эффекты легочной эвтаназии СО 2.
- Pin руки и ноги на вскрытии борту. Сделать разрез вдоль середины брюшной стороне с помощью ножниц. Осторожно потяните кожу и выставить грудных мышц стенки.
- Сделать разрезы через грудной мышцы стене подвергать органов брюшной полости.
- Держите киль грудной кости с пинцетом и прокола диафрагмы. Сокращение диафрагмы по бокам грудной клетки.
- С ножницами параллельно поверхности платы вскрытия, прорезать грудной полости вдоль дорзо-вентральной линии с обеих сторон.
- Слегка поднимите грудную клетку вверх. На правой стороне сердца, только под тимуса, обратите внимание на два лимфатических узлов. Чуть больше третьей лимфатических узлов находится под небольшим артериального кровеносного сосуда, что перпендикулярно трахеи. Урожай лимфатических узлов в 1 мл смеси пищеварения лимфатических узлов.
- После сбора урожая лимфатических узлов, держите сердца с парой щипцов и захватить легкие с другом. Урожай легких в 3 мл ледяной PBS в 6-луночный планшет.
- Отдельные долях легких, аспирация PBS и нарезать на небольшие доли части, используя щипцы и ножницы. Добавить 3 мл пищеварения смесь для легких. Держите 6-луночный планшет на льду во время этого шага.
- Инкубируйте лимфатических узлах в течение 25-30 мин и легких в течение 30 мин при 37 ° C. Добавить ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ каждого из пищеварение смеси для остановки реакции и место на льду.
- Использование 3 мл шприца, проходят куски легких через 18GA иглой в 3 раза. Маш куски легких и LNS через 70-100 мкм ячейки сита использованием задней части 1 мл поршень шприца. Вымойте ячейки сита с 10 мл HBSS без Са 2 + и Mg 2 +. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин.
- Ресуспендируют гранул в 5 мл буфера для лизиса эритроцитов и инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре. Добавить 10 мл HBSS без Са 2 + и Mg 2 +, чтобы утолить лизиса. Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин. Доведите до легкого и LDLN одного клеточных суспензий в 10 мл и 5 мл соответственно. Граф живых клеток использованием hemacytometer по трипанового синего исключения. Клетки готовы к пятном для проточной цитометрии. 1 доли легкого может быть достаточно для проточной цитометрии. Другие долей может быть использован для других экспериментальных вопросов, относящихся к той же мыши, такие как гомогенатах для цитокинов или тканей для гистологии.
5. Представитель Результаты:
НРС и альвеолярных макрофагов в легких приобрести антигена из альвеолярных пространств легких сразу после его введения. На рисунке 3 показан процент CD11c + (выраженные по НРС и альвеолярных макрофагов) клетки, которые являются положительными для флуоресцентно меченных спорами сибирской язвы Bacillus, 30 мин после его введения. В это время, ~ 15,9% CD45 + CD11c + клеток в легких суспензии отдельных клеток питал Bacillus сибирской язвы споры (рис. 3, нижняя панель). Для дальнейшей характеристики CD11c + клеток в легких, относятся к Ким и Braciale 4. Флуоресцентно меченных бисером обычно используются для оценки торговли частиц антигенов LDLNs 9. Для оценки этого транспорта из легких LDLNs, люминесцентные бусины латекса вводили его с ЛПС и LDLNs были проанализированы на 24 HPI. Около 4% CD11c клетки привет в LDLNs питал люминесцентные бусины на 24hpi (рис. 4). Эти представитель эксперименты показывают, что этот протокол может быть эффективно использована для отслеживания клетки, которые приобретают вдыхании антигенов частиц в легкие, а затем движение их LDLNs.
Рисунок 1. Деревянная платформа для сдерживания мышей во время его введения. Деревянный брусок был вырезан под углом, и металлические прутья были установлены, вид спереди рисунке 1а) и вид сбоку рисунок 1b). Небольшой кусочек проволоки, намотанной металлическим прутом, чтобы закрепить передних резцов мыши. Кусок ленты был прикреплен к платформе, чтобы связать вокруг мыши, чтобы держать его на месте во время процедуры.
Рисунок 2. Желудочный зонд игла для его введения. Зонд иглу (справа) была согнута под углом ~ 135 ° (слева) для нее инъекции.
Рисунок 3. Процент всех CD11c + клеток в легких, которые укрывают его вводят GFP выражения Bacillus сибирской язвы (Стерн-p6GFP), 5 часов после заражения. AJ мышей проблемы с 1x10 8 GFP-сибирской язвы Bacillus споры и легкие были проанализированы в 5 часов после инфекции. Точка графики показывают процент CD11c + клетки легких, которые являются положительными для сибирской язвы Bacillus.
Рисунок 4. Обнаружение флуоресцентные шарики (желтый / зеленый) в легких дренаж лимфатических узлов 24 часов после я. Инъекция т. AJ мышам либо PBS (левая панель) или 5x10 9 Fluoresbrite Ю.Г. микросфер (0.5μm) с 10 мкг ЛПС (справа) и его LDLNs были проанализированы 24hpi. Представитель точка графики показывают процент CD11c клетки привет в LDLNs, которые укрывают люминесцентные бусины заговор против пустой канал.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы использовали этот протокол для исследования торговли спор сибирской язвы Bacillus от легких к LDLNs. Для подобных приложений, число частиц, которые подаются в легкие должны быть тщательно выбраны так, что вводится материал может быть обнаружен в LDLNs с помощью проточной цитометрии. Мы также успешно использовал этот метод для приемных передачи клетки и маркировки конкретных легких клеточных популяций использованием флуоресцентно меченых антител. Кроме того, этот метод широко используется для управления блеомицин (химический индуктор легочный фиброз) и цитокины, непосредственно в легких 10.
Хотя этот метод позволяет последовательно доставку тестовых материалов в легких, она требует длительной подготовки и проверки (достигается за счет формирования красителя в легкие). Этот метод не может иметь такой же физиологическое значение, как другие пути ингаляции, поскольку не включает верхних дыхательных путей, где важно взаимодействие и иммунный ответ может быть начато. Тем не менее, желательно, где интерпретация может быть осложнен поглощение вводить агент, регионарные лимфатические узлы в области головы и шеи и стимуляцией дыхательного эпителия кишечного тракта. Как и во всех моделях, экспериментальных факторов, таких как доза, транспортное средство для доставки, распределения вводят материал, повреждения дыхательного эпителия и последствия наркоза все должны быть рассмотрены при разработке экспериментов. По сравнению с обычными процедурами для него инстилляции, мы считаем, что этот метод значительно уменьшает повреждение эпителия дыхательных путей. Тем не менее, соответствующие контрольные группы должны быть использованы для объяснения травмы после повреждения в месте прививки может повлиять доставки антигенов на лимфатические узлы 11. Мы рекомендуем использовать солевые как транспортное средство, но если испытуемого материала требует особых средств массовой информации на предмет эффективности, транспортное средство контроля не следует пренебрегать. Распределение вводили частицы материала в различных долях легких может быть важным параметром для некоторых экспериментов. В таких случаях, каждая из долей могут быть проанализированы отдельно сразу же после его введения. Распространение материалов в различных долях легких после него маршрут инстилляции был описан Коста и др. 12.
Мы сосредоточим наши анализа на осушение лимфатические узлы, описанные выше, которые доступны в большинстве дикого типа и выбить линий мышей, используемых в наших лабораториях. Однако Есть дополнительный дренаж лимфатических узлов в грудной области 13,14, которые также могут быть проанализированы. Если более лимфатических узлов желательно эксперимент, мы рекомендуем первоначальной идентификации использованием IP-инъекции флуоресцентного бисера, как описано в протоколе. Два из лимфатических узлов, которые мы рекомендуем для анализа, в непосредственной близости от тимуса поэтому следует соблюдать осторожность во время извлечения.
Как уже упоминалось, этот метод может быть адаптирован к подвергать легких к различным инфекционным организмов, аллергенами или токсинами. Она обеспечивает простой и последовательный альтернативой традиционным маршрутам вдыхание и исключает верхних дыхательных путей. Это особенно полезно для экспериментов, направленных на события, которые инициируют в легких и легких дренаж лимфатических узлов, прежде чем любой другой сайт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell stariner | BD Biosciences | ||
| Aniline Blue | Fisher Scientific | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington Biochemical | ||
| Collagenase D | Roche Group | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc. | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc. | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | Welch Allyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd, Inc. |
References
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).
- Bar-Haim, E. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).
- Kim, T. S., Braciale, T. J. Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses. PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).
- Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity. J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).
- Thomas, R. J. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. J Med Microbiol. , (2010).
- Kiyono, H., Fukuyama, S. NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).
- Parungo, C. P. Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics. Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).
- Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen. J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).
- Higgins, D. M. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).
- Kool, M. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J Exp Med. 205, 869-869 (2008).
- Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope. Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).
- Takahashi, S., Patrick, G. Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat. Lab Anim. 21, 31-31 (1987).
- Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).
