Summary
Vi illustrerar icke-kirurgisk leverans av provmaterial i lungorna på sövda möss via luftstrupen. Denna metod medger lung exponering mot bakteriella och virala patogener, cytokiner, antikroppar, pärlor, kemikalier eller färgämnen. Vi ytterligare beskriva skörd och förädling av lungorna och lungor dränerande lymfkörtlar (LDLNs) för flödescytometri.
Abstract
Fagocytiska celler såsom alveolära makrofager och lungceller dendritiska (MUL) prov kontinuerligt antigener från alveolarutrymmena i lungorna. Minst utvecklade länderna, i synnerhet, är kända för att migrera till lungan dränerande lymfkörtlar (LDLNs) där de presenterar inhalerade antigener till T-cellerna att initiera ett lämpligt immunsvar mot olika immunogens 1,2. Att modellera samspelet mellan lungorna och luftburna antigener i möss, kan antigen ges intranasalt 1,3,4, intratracheally 5 eller aerosoler 6. Leverans av varje rutt innebär olika tekniska färdigheter och begränsningar som måste beaktas innan utforma ett experiment. Till exempel ger intranasal och aerosoliserade exponering antigener till både lungor och övre luftvägarna. Därför antigener kan komma åt näsan tillhörande lymfatisk vävnad (NALT) 7, vilket kan försvåra tolkningen av resultaten. Dessutom kan svälja, nysningar och andning av musen leder också till inkonsekvenser i den levererade doser. Även medverkan av de övre luftvägarna kan vara att föredra för vissa studier kan det försvåra experiment som fokuserar på händelserna just inletts i lungorna. I den här inställningen är intratrakeal (IT) väg att föredra eftersom det ger testmaterial direkt in i lungorna och kringgår NALT. Många det injektion protokoll innebära antingen blinda intubation av luftstrupen via munhålan eller kirurgisk exponering av luftstrupe att få tillgång till lungorna. Häri beskriver vi en enkel, konsekvent, icke-kirurgisk metod för det instillation. Öppnandet av luftstrupe visualiseras med hjälp av en laryngoskopet och en böjd sondmatning nål införs därefter direkt in i luftstrupen för att leverera innoculum. Vi beskriver också rutiner för skörd och förädling av LDLNs och lungor för analys av antigen handel med flödescytometri.
Protocol
1. Innan processen, förbereda och samla in följande objekt
- Se bilden i Figur 1a) och 1b) för att bygga en trä plattform för att hålla musen under förfarandet.
- Uppslutning mix för lymfkörtlar - HBSS + 1.25mg/ml kollagenas TypeIV eller 2,5 mg / ml kollagenas D
- Uppslutning mix för lungorna - HBSS + 1 mg / ml kollagenas
- Späd latex pärlor (1:20) i PBS för intraperitoneal injektion att visualisera LDLNs
Obs: LDLNs är små och svåra att hitta. Information om hur du hittar dem, injicera 200μl av 1:20 utspädd röda fluorescerande latex pärlor ip i musen. Bukhinnan avlopp till dessa LDLNs 8. 24 HPI, utsätta brösthålan av musen som beskrivs ovan. Den LDLNs kommer att visas rosa från kulorna som dräneras från bukhålan.
- Röda blodkroppar (RBC) lyseringsbuffert - 0,15 NH 4 Cl, 10mm KHCO 3, 0,1 mM Na 2 EDTA i 1L dH 2 0. Justera pH till 7,2-7,4 och förvara i rumstemperatur.
- 70μm eller 100μm cell sil
- Stamlösning av 0,5 M EDTA, pH = 8,0
- HBSS utan CaCl 2 och MgCl 2
- Saxar och trubbig slutade tång
- Laryngoscope
- Sondmatning nål (22 gauge) böjda i vinkel (Figur 2)
- Frigolit ombord och om du vill ha sprida musen
- Top vågskålar
- Anilin Blå lösning - 10mg/ml i H 2 O
Notera: Vi kommer att använda denna lösning för demonstration av den injektionsteknik.
2. Beredning och administrering av mus bedövning
- Förbered en blandning av Xylazine och ketamin i sterila PBS så att den slutliga koncentrationerna 2mg/ml och 10mg/ml respektive.
- Väg musen på en topp vågskål.
- Beräkna den dos som krävs för varje mus. Dos vid Xylazine (2-4 mg / kg) och ketamin (70-80 mg / kg) kroppsvikt med hjälp av lämplig volym av den färdigberedda blandningen och injicera intaperitoneally. Varje musstam kan kräva optimering av narkos. Möss som fick för mycket narkos kan ha en minskad andningsfrekvens som kunde vara dödlig efter inokulat har ingjutit in i lungorna.
- Efter 3-5 minuter, observera musen för effekterna av narkos. Kontrollera följande tecken för att bekräfta att musen är helt sövd:
- Den andning ska sakta ner.
- Musen bör inte sträcka sin arm när plockas upp av nacken.
- Det ska inte finnas något svar när bakbenen stimuleras.
Om dessa kriterier inte uppfylls, vänta några minuter och kontrollera igen innan du fortsätter till nästa steg.
3. Intratrakeal injektion
- Förbered innoculum i 50μl koksaltlösning. Fyll en 1 ml spruta med en steril böjd sondmatning nål med innoculum. Sprutan ska laddas med en 100μl luftficka bakom innoculum att säkerställa att alla av vätskan är instilleras i lungan.
- Placera musen på den vinklade trä plattform hängande genom dess framtänder på tråd och försiktigt hålla den på plats med en bit band.
- Sätt på laryngoskopet med vänster hand (om du har rätt delas) och ta ett par trubbigt slutade tång. Använd spetsen på laryngoskopet och pincett för att försiktigt bända upp munnen.
- Med pincett, dra ut tungan och håll den åt sidan. Guide laryngoskopet bladet bakåt i munnen. Håll laryngoskopet nedtryckt mycket försiktigt i 90 ° vinkel tills du ser öppnandet av luftstrupen. Håll laryngoskopet på plats. Försiktighet bör iakttas när du drar tungan från munnen och detta bör göras försiktigt så att ingen vävnad skador uppstår.
- Med andra handen, ta 1 ml sprutan som innehåller innoculum, försedd med böjda sondmatning nål med din högra hand och stick in nålen i luftstrupen tills böjas i nålen är av fronten framtänderna. Tryck in kolven jämnt att leverera innoculum. Det innoculum ska inte bubbla. Dra ut injektionsnålen ur luftstrupen så snart som möjligt. Möss kommer att kvävas och dö om luftstrupen är blockerad för länge. Håll musen upprätt i några sekunder för att låta innoculum för inandning i lungorna.
- Ta musen ur plattformen och placera den nära ett värme-lampa. Lämna inte möss under direkt värme under längre perioder. Musen bör vara helt vaken inom 30 min efter ingreppet (återhämtningstiden kan variera beroende på stammar). Möss bör observeras noggrant under denna tid och bör inte tillåtas att bli för varmt eller för kallt kan detta också lagt mössen i andnöd leder till döden.
4. Skörd och förädling Lung dränerande lymfkörtlar och lungor för flödescytometri
- Sacrifice möss med önskad metod enligt de AVMA dödshjälp riktlinjer. Detta kan variera beroende på enskilda skörd resultat. Administrering av en dödlig inte av natrium pentobarbital är ett exempel på en lämplig dödshjälp förfarande. Vi har inte sett negativa pulmonella effekter av dödshjälp av CO 2.
- Nåla fast armar och ben på en dissekering ombord. Gör ett snitt längs mitten på den ventrala sidan med en sax. Dra försiktigt ut huden och exponera bröstkorgen muskler.
- Gör snitt genom bröstkorgen muskler att exponera bukorganen.
- Håll spetsen av bröstbenet med pincett och punktera membranet. Klipp membranet längs sidorna av bröstkorgen.
- Med saxen parallellt med dissektion styrelsen ytan, skär genom brösthålan längs Dorso-ventrala linje på båda sidorna.
- Lyft bröstkorgen upp. På höger sida av hjärtat, precis under bräss, leta efter två lymfkörtlar. En något större third lymfkörtel ligger nedanför ett litet arteriellt blodkärl som löper vinkelrätt mot luftstrupen. Harvest lymfkörtlar i 1 ml lymfkörtel matsmältningen mix.
- Efter skörden lymfkörtlar, håll hjärta med en pincett och ta tag i lungorna med en annan. Harvest lungor i 3 ml av iskall PBS i en 6-brunnar.
- Separera loberna i lungorna, aspirera PBS och hacka loberna i små bitar med hjälp av pincett och sax. Tillsätt 3 ml av matsmältningen blanda i lungorna. Håll 6-brunnar på is under detta steg.
- Inkubera lymfkörtlarna i 25-30 min och lungor i 30 minuter vid 37 ° C. Lägg EDTA till en slutlig koncentration av 10 mm till varje matsmältningen blandningar att stoppa reaktionen och lägg på is.
- Med hjälp av en 3 ml spruta, passerar delar av lungorna genom en 18GA nål 3 gånger. Mosa bitarna av lungorna och LNS genom 70-100μm cell silar med den bakre änden av en 1 ml sprutkolven. Tvätta cellen silar med 10 ml HBSS utan Ca 2 + och Mg 2 +. Centrifugera vid 500 xgi 5 minuter.
- Suspendera pelleten i 5 ml RBC lyseringsbuffert och inkubera i 3 min i rumstemperatur. Tillsätt 10 ml HBSS utan Ca 2 + och Mg 2 + att släcka lys. Centrifugera vid 500 xgi 5 minuter. Få upp lungorna och LDLN enda suspensioner cell till 10 ml och 5 ml respektive. Räkna levande celler med hjälp av en hemacytometer av trypan blå utslagning. Celler är nu redo för att färga för flödescytometri. 1 lob av lungan kan vara tillräcklig för flödescytometri. Andra lober kan användas för andra experimentella frågor inom samma mus som homogenat för cytokiner eller vävnad för histologi.
5. Representativa resultat:
Minst utvecklade länderna och alveolära makrofager i lungorna skaffa antigen från alveolarutrymmena i lungorna omedelbart efter den injektion. Figur 3 visar andelen CD11c + (uttryckt på minst utvecklade länderna och alveolära makrofager) celler som är positiva för fluorescerande sporer av Bacillus anthracis, 30 min efter den injektion. Vid denna tid hyste ~ 15,9% av CD45 + CD11c + celler i lungan enda cellsuspension Bacillus anthracis sporer (Figur 3, lägre paneler). För ytterligare karakterisering av CD11c + celler i lungorna, se Kim och Braciale 4. Fluorescerande kulor används rutinmässigt för att bedöma handel med partiklar antigener till LDLNs 9. För att bedöma denna transport från lungorna till LDLNs var fluorescerande latex kulor injicerade den med LPS och LDLNs analyserades vid 24 HPI. Cirka 4% av CD11c hej celler i LDLNs hyste fluorescerande pärlor på 24hpi (Figur 4). Dessa representativa experiment visar att detta protokoll effektivt kan användas för att spåra celler som förvärvar inandas partiklar antigener i lungorna och därefter trafik dem till LDLNs.
Figur 1. Trä plattform för att hålla fast möss under den injektion. Ett träblock skars i en vinkel och metallstänger var monterad framifrån Figur 1a) och från sidan figur 1b). En liten bit av tråden var lindad runt metallen baren för att förankra framför incisiverna av musen. En bit av bandet var knutna till den plattform att knyta runt musen för att hålla den på plats under förfarandet.
Figur 2. Sondmatning nål för den injektion. En sondmatning nål (till höger) var böjd i en vinkel på ~ 135 ° (vänster) för den injektion.
Figur 3. Procent av alla CD11c + celler i lungorna som hyser det injiceras GFP uttrycka Bacillus anthracis (Sterne-p6GFP), 5hrs inlägg utmaning. AJ möss utmaningen med 1x10 8 GFP-Bacillus anthracis sporer och lungorna analyserades vid 5hrs efter infektion. Punkten tomter visar andelen CD11c + lungceller som är positiva för Bacillus anthracis.
Figur 4. Upptäckt av fluorescerande kulor (gul / grön) i lungan dränerande lymfkörtlar 24 timmar efter jag. T injektion. AJ möss fick antingen PBS (till vänster) eller 5x10 9 Fluoresbrite YG Mikrosfärer (0.5μm) med 10 mikrogram LPS (höger panel) på den och LDLNs analyserades 24hpi. Representant dot tomter visar andelen CD11c hej celler i LDLNs att hamnen fluorescerande pärlor plottas mot en tom kanal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har utnyttjat detta protokoll för att studera handel med sporer av Bacillus anthracis från lungorna till LDLNs. Av liknande ansökningar bör antalet partiklar når lungorna väljas med omsorg så att det injicerade materialet kan påvisas i LDLNs med flödescytometri. Vi har också framgångsrikt använt denna metod för adoptiv transfer av celler och märkning av särskilda populationer lunga cell med fluorescerande antikroppar. Dessutom är den här metoden rutinmässigt används för att administrera bleomycin (en kemisk inducerare av pulmonell fibros) och cytokiner direkt in i lungorna 10.
Även om denna metod ger konsekvent leverans av provmaterial i lungorna, det kräver omfattande utbildning och validering (uppnås genom att ingjuta färgämne i lungorna). Denna metod kan inte ha samma fysiologiska betydelsen som andra vägar för inandning eftersom den utesluter de övre luftvägarna där viktiga interaktioner och immunsvar kan inledas. Dock är det bättre där tolkning kan kompliceras av upptag av den administrerade agenten av regionala lymfkörtlar i huvud och hals och genom stimulering av andningsvägarna epitelet. Som med alla modeller bör experimentella faktorer som dos, fordon för leverans, distribution av den injicerade materialet, skador på respiratoriska epitelet och effekterna av anestesi alla anses samtidigt utforma experiment. Jämfört med konventionella metoder för det instillation, tror vi att denna metod minskar skador på luftvägarna epitelet. Trots det bör lämpliga kontrollgrupper användas till svars för skada eftersom skador på platsen för ympningen kan påverka leveransen av antigener till lymfkörtlarna 11. Vi rekommenderar att använda saltlösning som en bil, men om provet kräver särskild media för effektivitet bör fordonets reglage inte försummas. Fördelning av det injicerade partiklar i de olika loberna i lungorna kan vara en viktig parameter för vissa experiment. I sådana fall kan var och en av loberna att analyseras var för sig omedelbart efter den injektion. Distributionen av material till de olika loberna i lungorna efter den sträckning instillation har beskrivits av Costa et al 12.
Vi fokuserar vår analys på dränerande lymfkörtlar som beskrivs ovan som är tillgängliga i de flesta vildtyp och slå ut stammar av möss som används i våra laboratorier. Det finns dock ytterligare dränering lymfkörtlar i bröstkorg regionen 13,14 som också kan analyseras. Om fler lymfkörtlar är önskvärda för ett experiment, rekommenderar vi inledande identifiering med hjälp av ip injektion av fluorescerande pärlor som beskrivs i protokollet. Två av de lymfkörtlar som vi rekommenderar för analys i närheten av bräss försiktighet bör därför tas under extraktion.
Som tidigare nämnts kan denna metod anpassas till utsätta lungorna till olika smittsamma organismer, allergener och toxiner. Det ger en enkel och konsekvent alternativ till konventionella vägar för inandningsexponering och utesluter de övre luftvägarna. Det är särskilt användbart för experiment som fokuserar på händelser som initierar i lungorna och lungorna dränerande lymfkörtlar innan någon annan sajt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell stariner | BD Biosciences | ||
| Aniline Blue | Fisher Scientific | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington Biochemical | ||
| Collagenase D | Roche Group | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc. | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc. | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | Welch Allyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd, Inc. |
References
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).
- Bar-Haim, E. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).
- Kim, T. S., Braciale, T. J. Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses. PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).
- Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity. J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).
- Thomas, R. J. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. J Med Microbiol. , (2010).
- Kiyono, H., Fukuyama, S. NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).
- Parungo, C. P. Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics. Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).
- Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen. J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).
- Higgins, D. M. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).
- Kool, M. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J Exp Med. 205, 869-869 (2008).
- Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope. Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).
- Takahashi, S., Patrick, G. Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat. Lab Anim. 21, 31-31 (1987).
- Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).
