Summary
我们说明进入肺部通过气管内麻醉小鼠的非手术治疗提供试验材料。这种方法允许肺暴露于细菌和病毒的病原体，细胞因子，抗体，珠子，化学品，染料。我们进一步描述采伐和肺和肺淋巴结（LDLNs），流式细胞仪检测处理。
Abstract
连续采样在肺部的肺泡吞噬细胞，如肺泡巨噬细胞和肺树突状细胞的最不发达国家（LDCs）的抗原。最不发达国家，特别是被称为迁移到肺淋巴结（LDLNs）他们目前吸入各种免疫原1,2发起一个适当的免疫反应的T细胞抗原。肺和空气中的抗原在小鼠模型之间的相互作用，抗原滴鼻给药1,3,4，气管或气溶胶6。每条路线交货涉及不同的技术技能和限制，需要考虑设计一个实验之前。例如，鼻腔和雾化曝光提供抗原肺部和上呼吸道。因此，抗原可进入鼻相关淋巴组织（NALT）7，潜在的复杂结果的解释。此外，吞咽，打喷嚏和鼠标的呼吸频率，也可能导致在交付的剂量不一致。虽然上呼吸道的参与可能是一些研究的首选，它可以实验侧重于专门在肺部发起的事件复杂化。在这种背景下的气管（IT）的路线是可取的，因为它提供的测试材料，直接进入肺部，并绕过NALT。许多注射协议涉及要么盲目通过口腔或气管的手术暴露访问肺部气管插管。在这里，我们描述了一个简单的，一致的，它滴入的非手术方法。气管的开放是可视化使用喉镜和弯曲灌胃针插入进气管直接提供innoculum的。我们还描述了采伐和加工用流式细胞仪分析抗原贩运LDLNs和肺部的程序。
Protocol
1。之前的过程中，准备和收集下列项目
- 请参考图1a中的形象）和1b为建设一个木制的平台，以抑制在操作过程中鼠标）。
- 消化混合淋巴结 - 的HBSS + 1.25mg/ml胶原酶TypeIV或2.5 mg / mL胶原酶ð
- 消化肺部混合 - 的HBSS + 1 mg / mL胶原酶
- 稀释在PBS腹腔注射乳胶珠（1:20）的LDLNs可视化
注：LDLNs很小，很难找到。要了解如何找到他们，注入200μL稀释的红色荧光乳胶珠到鼠标的IP 1:20。腹膜水渠这些LDLNs 8。 24 HPI，暴露胸腔上面所述的鼠标。 LDLNs会出现粉红色的珠子从腹腔排水。
- 红细胞（RBC）的细胞裂解液- 0.15米的NH 4 CL，10MM KHCO 3，0.1毫米NA 2 EDTA 1L DH 2 0 。调整pH值到7.2-7.4，并在室温下保存。
- 70μm或100μm的细胞过滤器
- 商业解决方案0.5M EDTA，pH值= 8.0
- 氯化钙和氯化镁2的HBSS无
- 剪刀钝端钳
- 喉镜
- 灌胃针（22号）弯曲的角度（图2）
- 聚苯乙烯泡沫塑料板和传播鼠标引脚
- 顶盘天平
- 苯胺蓝溶液- 10mg/ml的H 2 O
注：我们将使用这一解决方案，为它注入技术的示范。
2。鼠标麻醉的制备和管理
- 在无菌PBS准备甲苯噻嗪和氯胺酮的混合物，使终浓度2mg/ml和10mg/ml的分别。
- 称量鼠标顶部泛平衡。
- 计算每个鼠标所需的剂量。在甲苯噻嗪（2-4毫克/公斤），氯胺酮（70-80毫克/公斤）体重的剂量使用的准备混合物适当的体积和注入intaperitoneally。每个小鼠品系可能需要麻醉剂的优化。接受过多麻醉的小鼠可能会降低呼吸速率，接种灌输到肺部后，可能是致命的。
- 3-5分钟后，观察麻醉效果的鼠标。下列标志的检查，以确认鼠标是完全麻醉：
- 呼吸速度应放慢。
- 鼠标不应延伸其手臂，颈部时捞起。
- 不应该有任何后肢刺激时的反应。
如果这些条件不能满足，等待几分钟，然后再次检查，然后再继续下一步。
3。气管内注射
- 准备在50μL生理盐水innoculum。填充1ml注射器装用无菌弯曲与innoculum灌胃针。背后的innoculum100μL空气袋应装入注射器，以确保所有的液体注入到肺。
- 广场上倾斜的木平台，其门牙挂在电线上的鼠标轻轻地抑制在一块色带。
- 打开喉镜，用左手（如果你是右撇子）和抢一双钝结束钳。使用喉镜和镊子的尖端轻轻撬开口。
- 随着钳，拉舌，抱到一边。指南对口腔后部的喉镜片。保持在90度角，轻轻地按下，直到你看到气管开放喉镜。握住喉镜到位。时从嘴里拉出舌头和应做轻轻的发生，使无组织损伤，应该小心。
- 用另一只手，采取包含innoculum，你的右手弯曲灌胃针装有1ml注射器，插入气管针，弯针，直到前门牙。均匀推柱塞提供innoculum。 innoculum应该没有泡沫。尽快拉出气管针。老鼠窒息死亡，如果时间过长阻塞气管。按住鼠标几秒钟直立允许进入肺部吸入innoculum。
- 鼠标的平台和地点附近的一个取暖灯。不要直接加热下离开小鼠长时间。鼠标应在30分钟内完全清醒后的程序（恢复时间可能会有所不同的基础上株）。在此期间，应努力观察小鼠和不应该允许太热或太冷，这可能也把到呼吸窘迫导致死亡的小鼠。
4。采伐和加工的龙引流淋巴结和肺流式细胞仪
- 牺牲小鼠使用所需的方法，为每AVMA安乐死指引。这可能会有所不同，取决于个人收获的成果。致命的钠不巴比妥管理是一个合适的安乐死程序的一个例子。我们还没有看到的CO 2安乐死的负肺效应。
- 引脚的上夹层板的胳膊和腿。使切口，沿中间用剪刀腹侧。轻轻拉动皮肤暴露胸壁的肌肉。
- 通过胸壁肌肉的切口，暴露腹部器官。
- 按住胸骨尖镊子和穿刺隔膜。切沿左肋双方的隔膜。
- 用剪刀夹层板表面平行，穿过沿背腹线两侧胸腔。
- 稍微解除左肋。在右侧的心，只是下面胸腺，寻找两个淋巴结。一个稍大的第三个淋巴结是位于下方的小动脉血管，气管垂直运行。收获淋巴结肿大，淋巴结消化混合成1毫升。
- 收获后淋巴结肿大，与一双镊子的心脏和抓住与另一肺部。收获到冰冷的PBS3毫升肺在6孔板。
- 独立的肺部叶，吸出PBS及使用镊子和剪刀切成小块耳垂。添加肺部消化混合3毫升。在这一步，保持6孔板上的冰。
- 25-30分钟和30分钟的肺部淋巴结在37 ° C。加入EDTA至终浓度为10mm消化混合物停止反应，并置于冰上。
- 使用3毫升注射器，通过18GA针肺片的3倍。捣碎件通过70 -100μm的细胞过滤器使用一个1ml注射器柱塞回结束的肺部和淋巴结。洗净无钙的HBSS10毫升细胞过滤器+和Mg 2 +。在500 XG离心5分钟。
- 5毫升红细胞裂解液重悬沉淀和孵化在室温下3分钟。添加无钙的HBSS10毫升+和Mg 2 +淬火溶解。在500 XG离心5分钟。调出肺癌和LDLN单细胞悬液，分别至10ml和5毫升。使用一个hemacytometer活细胞计数台盼蓝拒。细胞现在已经准备好，染色流式细胞仪。 1叶肺，可能是足够的流式细胞仪。其他叶可用于其他实验问题，在相同的鼠标，如细胞因子或组织学组织匀浆。
5。代表性的成果：
最不发达国家和在肺部的肺泡巨噬细胞获得抗原从肺部的肺泡，紧随其后注射。图3显示的CD11c +（表示对最不发达国家和肺泡巨噬细胞）的百分比细胞，荧光标记的炭疽杆菌孢子积极，30分钟后，注射。 〜15.9％，CD45 +的CD11c +细胞肺癌单细胞悬液，在这个时候，包庇炭疽杆菌孢子（图3，下板）。在肺部的CD11c +细胞的进一步鉴定，是指金正日和Braciale 4 。经常使用荧光标记的珠子，以评估贩卖颗粒抗原LDLNs 9 。为了评估这从肺部LDLNs运输，荧光乳胶珠注射LPS和24 HPI分析LDLNs。约4％的CD11c 您好细胞的LDLNs包庇24hpi（图4）的荧光珠。这些代表性的实验表明，这个协议可以有效地用于跟踪收购吸入颗粒抗原的细胞在肺部，随后交通的LDLNs。
图1。在它注射抑制小鼠的木制平台 。木块在一个角度切入，金属栏杆安装，前视图图1a）和侧视图图1b） 。伤口周围的金属条电线的一小片，锚鼠标的前门牙。一块色带连接到平台，围绕鼠标配合到位，在手术过程中保持。
图2。它注射针灌胃。灌胃针（右）〜135 °（左）为它注入的角度弯曲。
图3。所有海港注入绿色荧光蛋白表达炭疽杆菌 （星级p6GFP），5小时后的挑战肺部表面CD11c +细胞的百分比。 AJ。小鼠用1X的挑战在5小时后感染10 8 GFP的炭疽杆菌孢子和肺部进行了分析。点图显示的CD11c百分比+肺炭疽杆菌阳性的细胞， 。
图4。 （黄/绿）在肺癌淋巴结我... ...吨注射24小时后检测荧光珠 。 AJ小鼠给予10μg脂多糖（右图）和LDLNs分析24hpi要么PBS（左侧面板）或5X10 9 Fluoresbrite永贵微球（0.5微米）。代表点图显示在LDLNs海港荧光珠对绘制一个空通道的CD11c 您好细胞的百分比。
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Discussion
我们利用这个协议，从肺到LDLNs 研究炭疽杆菌孢子的贩运。对于类似的应用程序，传送到肺部的颗粒数应慎重选择，使注射材料可通过流式细胞仪检测的LDLNs。我们还成功地使用这种方法为具体的肺细胞用荧光标记抗体的人口的细胞和标签的收养转移。此外，这种方法是经常使用的管理直接进入肺部10博莱霉素（化学诱导的肺间质纤维化）和细胞因子。
尽管此方法允许进入肺部的测试材料的交付一致的，它需要广泛的培训和验证（灌输染料进入肺部取得）。此方法可能不会有相同的生理相关吸入其他途径，因为它排除了上呼吸道重要的相互作用，可启动免疫反应。然而，这是最好的解释可以由摄取的管理代理复杂，在头部和颈部区域淋巴结和呼吸道上皮细胞的刺激。实验因素，如剂量，对运载工具，注射材料，破坏呼吸道上皮和麻醉的效果分布与所有车型一样，都应该被视为设计性实验的同时。它灌输传统的程序相比，我们相信，这种方法大大降低了呼吸道上皮细胞的损伤。尽管如此，应使用适当的对照组考虑，因为损坏的损伤在接种部位可能会影响抗原传递至淋巴结11。我们建议使用生理盐水作为车辆，但如果测试材料需要特定媒体的有效性，车辆控制不容忽视。注入到肺部的不同叶颗粒物质的分布可能为某些实验的重要参数。在这种情况下，每个叶可立即分开以下，注射分析。材料后分配到肺部的不同叶滴入路线已经由哥斯达黎加等12。
我们专注于引流淋巴结描述节点以上是在大多数野生型访问我们的分析和敲在我们的实验室中使用的小鼠株。不过，也有额外引流淋巴结也可能分析的胸地区13,14。如果更多的淋巴结是一个实验的理想，我们建议采用腹腔注射在协议中所述的荧光珠的初步鉴定。两个淋巴结，我们建议进行分析接近，因此在提取过程中应采取的胸腺。
如前所述，这种方法可适应揭露肺部各种感染性微生物，过敏原或毒素。它提供了一个简单而一致的的方法吸入暴露的传统路线，不包括上呼吸道。它是用于实验，重点是在任何其他网站的肺和肺淋巴结启动的事件特别有用。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell stariner | BD Biosciences | ||
| Aniline Blue | Fisher Scientific | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper & Sons, Inc. | 7920 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington Biochemical | ||
| Collagenase D | Roche Group | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc. | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc. | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | Welch Allyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd, Inc. |
References
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).
- Bar-Haim, E. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).
- Kim, T. S., Braciale, T. J. Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses. PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).
- Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity. J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).
- Thomas, R. J. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. J Med Microbiol. , (2010).
- Kiyono, H., Fukuyama, S. NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).
- Parungo, C. P. Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics. Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).
- Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen. J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).
- Higgins, D. M. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).
- Kool, M. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J Exp Med. 205, 869-869 (2008).
- Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope. Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).
- Takahashi, S., Patrick, G. Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat. Lab Anim. 21, 31-31 (1987).
- Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).
