Lentivirale-vermittelte Knockdown Während Ex Vivo Erythropoese von humanen hämatopoetischen Stammzellen

Summary

Ein

Abstract

Erythropoese ist eine häufig verwendete Modellsystem zur Untersuchung der Zelldifferenzierung. Während Erythropoese, pluripotenten adulten humanen hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) in oligopotent Vorfahren, engagiert Vorläufern und reifen roten Blutkörperchen Zellen ¹ zu unterscheiden. Dieser Prozess ist für einen großen Teil auf der Ebene der Genexpression, wobei spezifische Transkriptionsfaktoren aktivieren Linie-spezifischer Gene reguliert, während gleichzeitig unterdrücken Genen, die spezifisch für andere Zelltypen ² sind. Studien über Transkriptionsfaktoren regulieren Erythropoese sind oft unter Verwendung von humanen und murinen Zelllinien, stellen zum Teil erythroiden Zellen zu bestimmten Stadien der Differenzierung ^3-5. Allerdings transformierten Zelllinien nur teilweise imitieren erythroiden Zellen und vor allem sie nicht erlauben es, nachvollziehbar Studie der dynamischen Veränderungen, die als Zellen des Fortschritts ist möglich durch viele Stadien zu ihrer endgültigen erythroiden Schicksal. Somit bleibt eine aktuelle Herausforderung der Entwicklung eines Protokolls zu relativ homogenen Populationen von primären HSC und erythroiden Zellen in verschiedenen Stadien der Differenzierung zu erhalten, die in Mengen, die ausreichen, Genomik und Proteomik Experimente durchzuführen sind.

Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Zellkultur-Protokoll zu erythroiden Differenzierung von humanen hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen, die aus entweder Nabelschnurblut, Knochenmark oder dem peripheren Blut Erwachsener mit G-CSF (Leukapherese) mobilisiert wurden, isoliert zu induzieren. Diese Kultur zeichnet sich anfänglich durch die Douay Labor ⁶ entwickelt, nutzt Zytokine und Co-Kultur auf mesenchymale Zellen in die Knochenmark-Mikroumgebung nachahmen. Mit dieser ex vivo Differenzierung Protokoll, beobachten wir eine starke Verstärkung von erythroiden Vorläuferzellen, eine Induktion der Differenzierung ausschließlich auf die erythroiden Linie und eine vollständige Reifung auf der Bühne des entkernten roten Blutkörperchen. So bietet dieses System die Möglichkeit, den molekularen Mechanismus der Regulation der Transkription als hämatopoetische Stammzellen Fortschritte auf dem erythroiden Linie zu studieren.

Studieren Erythropoese auf der Transkriptionsebene erfordert auch die Fähigkeit, über-express oder Knockdown spezifische Faktoren in primären erythroiden Zellen. Zu diesem Zweck verwenden wir ein Lentivirus-vermittelte Gentransfer-System, das für die effiziente Infektion von beiden Teilen und nicht teilende Zellen ⁷ ermöglicht. Hier zeigen wir, dass wir in der Lage, effizient Knockdown des Transkriptionsfaktors TAL1 in primären humanen erythroiden Zellen sind. Darüber hinaus zeigt die GFP-Expression mit einem Wirkungsgrad von lentiviralen Infektion fast 90%. So bietet unser Protokoll ein sehr nützliches System für die Charakterisierung des regulatorischen Netzwerkes von Transkriptionsfaktoren, die Steuerung der Erythropoese.

Discussion

Eine Reihe von Methoden wurden bereits zu erythroiden Zellen in Kultur zu differenzieren mit variabler Grad von Erfolg eingesetzt. Zum Beispiel können einige Protokolle ohne Co-Kultur auf MS-5 Ausbau der erythroiden Zellen sind aber nicht in der Herstellung von voll ausgereiften entkernte rote Blutkörperchen ^12-17 effizient. Während bei anderen Methoden effizienter Enukleation ermöglichen, ist es auf Kosten der Verbreitung ^18,19. Die Methode, die wir hier verwendet haben, zunächst von der Douay Labor ⁶ entwickelt, verbindet eine erste flüssige Kultur Schritt, der Zelle Verstärkung verlängert während der frühen Stadien der erythroiden Differenzierung und somit bietet uns eine große Zahl von frühen Vorfahren (notwendig für Genomik und Proteomik-Studien) und einen zweiten Schritt des Co-Kultur auf MS-5 mesenchymalen Zellen, die wichtig für Hämoglobin-Synthese zu maximieren und die vollständige Enukleation der roten Blutkörperchen zu erhalten. Zwei Einschränkungen unserer Methode sind 1) die nach wie vor unzureichenden Verstärkung bei den frühesten Stadien der Differenzierung, die uns bisher daran gehindert hat, vollständig zu charakterisieren den sehr frühen erythroiden Vorläuferzellen auf Protein-Ebene und 2) die hohen Kosten für die Durchführung dieses Protokolls, vor allem auf ein groß angelegtes.

Die Qualität der Zellkultur-Reagenzien und Zytokine ist für ex vivo erythroiden Differenzierung. Insbesondere ist die Verwendung von BIT (Tabelle 2) als Serum-Ersatz kritisch. In der Tat nach unserer Erfahrung den Einsatz von BIT Charge zu Charge Schwankungen, die wir erlebt zuvor (wahrscheinlich aufgrund von Unterschieden in Reagenz Reinheit) bei der Verwendung von getrennten Quellen von Rinderserumalbumin, Insulin und Transferrin eliminiert. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Qualität der MS-5-Schicht für Co-Kultur von erythroiden Zellen verwendet. In der Tat muss MS-5-Zellen 70% konfluent sein, wenn erythroiden Zellen aufgenommen werden und muss alle 3-4 Tage sein. Wenn MS-5-Zellen zu konfluenten sind, wird erythroiden Zellen nicht wachsen und differenzieren richtig. Darüber hinaus neigen ungesunde MS-5-Zellen zu trennen, so dass die Ernte von erythroiden Zellen schwierig.

Bisherige Verfahren haben Retrovirus für die Gen-Delivery in hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen in Kultur verwendet. Allerdings infizieren Retroviren nur sich teilende Zellen und sind deshalb nicht effizient bei der Infektion der vor allem Ruhe CD34 ^+-Zellen aus Nabelschnurblut, Knochenmark oder Leukapherese ²⁰ isoliert. Der wesentliche Vorteil der lentiviralen Ansätze für die Gen-Delivery ist, dass es eine effiziente Infektion von Zellen unabhängig von ihrem Status Proliferation ^7,21 ermöglicht. Unsere lentiviralen-vermittelte Gentransfer ermöglicht es, effizient Knockdown oder über-express bestimmte Transkriptionsfaktoren, die Zelle Schicksal ändern können. Entsprechende phänotypische Analysen (zelluläre und molekulare) kann nach der Infektion auf bestimmte Phänotypen zeigen, erarbeitet werden. Darüber hinaus können Wachstumsbedingungen verändert werden, um insbesondere Zelltypen nach einer Infektion begünstigen. Entlang dieser Linien in diesem Protokoll haben wir uns entschieden, keine Methode verwenden, um Lentivirus-infizierten Zellen hauptsächlich aus zwei Gründen aus: 1) unsere Infektion ist sehr hoch (Abbildung 6C) und 2) sind wir besorgt, dass die Methoden zur Auswahl verwendet Lentivirus-infizierten Zellen (z. B. Zell-Sortierung oder Antibiotika) sind nach überlebenden / wuchernden Zellen, die in der Lage, weder ausdrücklich die Antibiotika-Resistenz-Gen oder das fluoreszierende Marker auf einem hohen Niveau und verdeckt dadurch eine potentielle apoptotischen Phänotyp vorgespannt sind.