Neuroscience

הקרנת Assay עבור סטרס חמצוני בתוך הקו Cell חתולים Astrocyte, G355-5

Published: July 13, 2011 doi: 10.3791/2841

Maria Pia Testa¹, Omar Alvarado¹, Andrea Wournell¹, Jonathan Lee², Frederick T. Guilford³, Steven H. Henriksen², Tom R. Phillips^1,2

¹College of Veterinary Medicine, Western University of Health Sciences, ²Graduate College of Biomedical Sciences, Western University of Health Sciences, ³ReadiSorb, Products

Summary

שיטת ההקרנה לזהות סביבות הסלולר חמצוני היא למדוד את החמצון של CM-H2DCFDA. לאחר חמצון מן הלא למתחם ניאון ניאון בתוך, תא CM-H2DCFDA שינויים. שינוי זה של הקרינה נמדדת cytometry זרימה ומציין את מספר התאים בסביבה חמצוני.

Abstract

לעתים קרובות, הציע מנגנון של וירוס המושרה נזק עצבי הוא סטרס חמצוני. האסטרוציטים יש תפקיד חשוב בשליטה על סטרס חמצוני של מערכת העצבים המרכזית (CNS). האסטרוציטים לעזור לשמור על הסביבה homeostatic עבור נוירונים, כמו גם נוירונים להגנה מפני מינים החמצן מגיב (ROS). CM-H2DCFDA הוא אינדיקטור התא חדיר עבור נוכחות של ROS. CM-H ₂ DCFDA נכנס לתא כמתחם לא ניאון, ואז הוא הופך ניאון לאחר esterases הסלולר להסיר את קבוצות אצטט, ואת מתחם מתחמצן. מספר תאים, נמדד על ידי cytometry זרימה, כי הם מצאו להיות fluorescing ירוק הוא אינדיקציה למספר התאים נמצאים במצב חמצוני. CM-H ₂ DCFDA רגיש חמצון על ידי מספר גדול של ROS שונים. חוסר הספציפיות, שלגביו ROS יכול לחמצן CM-H ₂ DCFDA, עושה את זה תרכובת עוצר ערך לשימוש בשלבים הראשונים של חקירת הפתוגנזה, כמו זו assay יכול לשמש מסך עבור הסביבה הסלולרית חמצוני ללא תלות חמצן רדיקלי או שילוב של ROS אחראים התנאים הסלולר. ברגע שזה נקבע כי ROS נוכחים ידי חמצון של CM-H ₂ DCFDA, אז ניסויים נוספים ניתן לבצע כדי לקבוע אילו ROS או שילוב של רוס מעורבים בתהליך הפתוגנזה בפרט. תוצאות המחקר הזה מראים כי עם תוספת של חמצן עלייה CM-H ₂ DCFDA לזרוח זוהה יחסית שולטת מלוחים, המציין כי assay זה מבחן חשוב לאיתור סביבה חמצוני בתוך G355-5 תאים, חתולים תא astrocyte קו.

Protocol

1. Cell תרבות של האסטרוציטים חתולים ולטיפול עם H ₂ O ₂

תא התרבות קו G355-5 ב בקבוקון 75 ס"מ ² עם התקשורת DMEM בתוספת חומרים מזינים ב 37 ° C ו 5% CO ₂ ומחוברות עד 60% (~ 5 ימים). החלף את המדיה כל 1-2 ימים או לפי הצורך לשמור על תרבות בריאה.
הסר מדיה להוסיף 2 מ"ל של טריפסין 0.25%. הרם את התאים על ידי pipetting עבור 45 שניות - 1 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
העבר במהירות את ההשעיה על צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של התקשורת. מערבבים בעדינות.
צנטריפוגה XG ב 300, 23 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות כדי לקבל גלולה. בטל supernatant מבלי להפריע גלולה.
הוסף 6-7 מ"ל של התקשורת טריים resuspend התאים.
הוסף את ~ 1 מ"ל של התאים היטב בכל צלחת 6 באר. הוסף 2-3 מ"ל של התקשורת זה טוב לדגור עד ומחוברות 80-90%.
הכן פתרון 100μM של מי חמצן (H ₂ O ₂₎ בתקשורת.
הסר מדיה מכל טוב ולהחליף או 2 מ"ל התקשורת טרי (שליטה), 2 מ"ל של H ₂ O ₂ (טיפול) או 2ml של DPBS. לדגור על 37 ° C CO, 5% ₂ עבור 3 ח
הסר פתרונות ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין להרים את התאים. העברת התאים צינור 1.7 Eppendorf מ"ל מכיל 0.5 DPBS מ"ל. צעד זה צריך להתבצע על כל אחד בנפרד גם כדי למנוע מוות של תאים מן טריפסין דגירה ממושכת.
ספין על XG 300 דקות 3, לבטל את supernatant ו resuspend ב 1 מ"ל של DPBS.

2. מכתים עבור ROS

צעדים עבור כל מכתים צריך להתבצע עם חשיפה לאור מינימלי כדי למנוע הלבנת.
הוסף 1 μl של CCCP 50 מ"מ לשלוט חיובית. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ דקות 5.
הוסף 5 μl של 10 CM-H פתרון mM DCFDA ₂ לקבוצה ₂ H ₂ O. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ דקות 15-30. כתם לא מתווסף המדגם מלוחים.
לשטוף דגימות עם 2 מ"ל של DPBS להסיר כתם שיורי.
ספין על XG 300 דקות 3 כדי לקבל גלולה.
Resuspend תאים 0.5 מ"ל של DPBS. הוסף 1 μl PI לטעום כל, למעט מלח.
העברת דגימות צינור הזרימה 5 מ"ל cytometer.
הפעלה על cytometer את הזרימה.

3. תזרים cytometry

הפעל דגימות על Beckman Coulter FC500 (או שווה ערך) מצויד 488 ננומטר ארגון לייזר עובר הלהקה הבאה: 525, 775 ו - 620 ננומטר, כל ± 20 ננומטר.
הכן את שולטת המתאים: תאים בלא כתם, מוכתם CM-H ₂ DCFDA בלבד, רק PI, מוכתם כפול (בקרה שלילית).
הפוך את פרוטוקול יש histoplots הבאים: FS מול אס, לצרכן לעומת CM-H ₂ DCFDA. זה צריך גם את היסטוגרמות הבאים: מספר התא לעומת FL1, fl2 ו FL3, התואמת את הכתמים.
לפני הפעלת דגימות, לבדוק, ציוד נוזלים מיכל פסולת. לחמם את ציוד דקות לפחות 20.
נקו את הציוד לבצע כיול עם חרוזים המתאים על פי הסטנדרטים היצרנים.
בחר פרוטוקול שלכם ולהפעיל את הדגימות.
נקו את הציוד כפי שנעשה בעבר.
נקו את קו ואקום פי הסטנדרטים היצרנים.
כבה את זרימת ולנקות את קו הראש / ואקום.
כבה את התוכנה ואת המחשב.

4. נציג תוצאות:

Cytometry תוצאות תזרים נותחו באמצעות FlowJo 7.6 ואת שולטת כתם שימשו אובייקטיבית להגדיר את gating. על בסיס זה, תאים בריאים להופיע בצד שמאל של ההיסטוגרמה ו ROS (סטרס חמצוני) זוהה כמו שינוי של תאים ימינה. איור 1 מציג את תוצאות ההשפעה של חמצן על האסטרוציטים חתולים בריאים. מנתוני FL1 שימש למדוד את העוצמה של CM-H ₂ DCFDA, אשר מעיד על קיומו של ROS. כצפוי, כמות גבוהה יותר של ROS זוהה במדגם שטופלו H ₂ O _2. זה מוצג על ההיסטוגרמה כמו שינוי בעוצמת פלורסנט משמאל לימין. כאשר משווים תאים בריאים שטופלו DMEM לעומת DPBS, לא חל שינוי משמעותי בהיקף של ROS (איור 2).

איור 1
1. תרשים זרימה cytometry תוצאות של רמות של סטרס חמצוני של האסטרוציטים חתולים בריאים ההשפעה של H ₂ O ₂ על תאים בריאים. תוצאות המחקר מראות כי H ₂ O ₂ מעלה את רמות של ROS בתאים בריאים לעומת תאים ללא טיפול (DMEM).

איור 2
2. תרשים זרימה cytometry תוצאות הרמות של ROS שהתגלו תאים בריאים מודגרות עבור 3hrs עם DPBS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המנגנון המוצע לעתים קרובות של הנגיף המושרה נזק עצבי הוא סטרס חמצוני ^{1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31.} בעיקרון, מוצע כי באמצעות חשיפה ויראלי גליה (האסטרוציטים ו microglia) לשחרר רדיקלים תגובתי כגון, הידרוקסיד, אניון superoxide, תחמוצת החנקן, ו / או מי חמצן, שהם רעילים לנוירונים. באופן דומה, סטרס חמצוני יש גם הציע כמנגנון פתולוגיים מרכזי מתאמפטמין-Induced neurotoxicity ^{2, 6, 17.} מאז הקבוצה מעוניינת את השפעת הווירוס וגם סמים של התעללות על מערכת העצבים המרכזית, אנו נבחר להשתמש מבחן מיון מהיר כדי לקבוע הנוכחי של ROS עודף האסטרוציטים. רוב גלוטתיון עצבי המיוצר על ידי האסטרוציטים, ומסר לאחר מכן את הנוירונים ^{5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30.} לכן, את תפקיד האסטרוציטים ב סטרס חמצוני חשוב בשמירה על הסביבה homeostatic עבור נוירונים, כמו גם להגן על הנוירונים מפני ROS, ואת הסיבה בתרביות תאים astrocyte נבחרו לצורך מחקר זה.

CM-H ₂ DCFDA ידוע גם בשם 2 ", 7'-dichlorofluorescein ו H2DCF. CM-H ₂ DCFDA הוא אינדיקטור התא חדיר עבור נוכחות של מינים חמצן תגובתי. CM-H ₂ DCFDA נכנס לתא כמתחם לא פלורסנט, אשר הופך ניאון לאחר esterases הסלולר להסיר את קבוצות אצטט, ואת המתחם הופך מחומצן. פעם בתוך התא לבין קבוצות אצטט מוסרים, CM-H ₂ DCFDA ניתן חמצון על ידי מספר מינים ROS, כולל תחמוצת החנקן, אניונים peroxynitrite, מי חמצן, hydroperoxides אורגני ^{3, 14, 25,} וכתוצאה מכך ירוק פלורסנט המוצר ^{23, 28.} חוסר לציין את ROS, אשר יכול לחמצן CM-H ₂ DCFDA, הופך אותו מגיב יקר בשלבים הראשונים של חקירת בפתוגנזה, שבה מנגנון סטרס חמצוני הוא האמין להיות משחק תפקיד, אך לא ידוע אשר חמצן רדיקלי יכול להיות מעורב, ולא מבחן בנפרד ROS. ברגע שזה נקבע כי ROS נוכחים ידי חמצון של CM-H ₂ DCFDA, אז ניסויים נוספים ניתן לבצע כדי לקבוע, אשר ROS או שילוב של רוס מעורבים בתהליך הפתוגנזה בפרט. תוצאות המחקר הנוכחי מראות כי עם תוספת של חמצן עלייה CM-H ₂ DCFDA לזרוח זוהה בהשוואה לשלוט מלוחים, המציין כי assay זה מבחן חשוב לאיתור סביבה חמצוני בתוך G355-5 תאים, קו חתולים תא astrocyte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אנו מודים מוצרים ReadiSorb על תמיכתם הנדיבה של מחקרים אלה.

Acknowledgments

אנו מודים מוצרים ReadiSorb על תמיכתם הנדיבה של מחקרים אלה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Cellgro	15-013-CV
MEM Vitamins	Cellgro	25-020-cl	1% (v/v)
L-glutamine	Hyclone	17-605E	1% (v/v)
Non Essential Amino Acids	Hyclone	25-025-cl	1% (v/v)
FBS	Hyclone	SH30071.03	20% (v/v)
Essential Amino Acids	Cellgro	25-030-cl	0.2% (v/v)
500ml vacuum filtration system	VWR international	87006-076
15 ml conical tubes	Falcon BD	352097
75 cm² tissue culture flasks	Falcon BD	353136
6 well tissue culture plate	Falcon BD	353224
CM-H₂DCFDA	Invitrogen	C6827
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170-10mg
Trypsin	Lonza Inc.	17-160F
H₂O₂	Sigma-Aldrich	H6520
HyQ Antibiotic	Hyclone	SV30079.01	0.1% (v/v)
G355-5 cells	ATCC	CRL-2033	Normal feline brain