Summary
En screeningmetod för att upptäcka oxidativ cellulära miljöer är att mäta oxidation av CM-H2DCFDA. När oxideras i en cell, CM-H2DCFDA förändringar från icke-fluorescerande i en fluorescerande förening. Denna förändring i fluorescens mäts med flödescytometri och anger antalet celler i en oxidativ miljö.
Abstract
En ofta föreslagna mekanismen för viruset orsakat neuronal skada är oxidativ stress. Astrocyter har en viktig roll i kontrollen oxidativ stress i centrala nervsystemet (CNS). Astrocyter bidra till att upprätthålla en homeostatic miljö för nervceller samt att skydda nervceller från reaktiva syreradikaler (ROS). CM-H2DCFDA är en cell-genomsläpplig indikator för förekomsten av ROS. CM-H 2 DCFDA in i cellen som ett icke-fluorescerande förening, och blir fluorescerande efter cellulära esteraser bort acetat grupper och substansen oxideras. Antalet celler, mätt med flödescytometri, som befinns vara gröna fluorescerande är en indikation på antalet celler som är i en oxidativ tillstånd. CM-H 2 DCFDA är känsligt för oxidation av ett stort antal olika ROS. Denna brist på specificitet om vilka ROS kan oxidera CM-H 2 DCFDA, gör denna förening en värdefull regent för användning i de tidiga stadierna av en patogenes undersökning, eftersom detta test kan användas för att screena för en oxidativ cellulär miljö oavsett vilken syre radikala eller kombinationer av ROS är ansvariga för den cellulära förhållanden. När det har konstaterats att ROS är närvarande genom oxidation av CM-H 2 DCFDA, sedan ytterligare experiment kan utföras för att avgöra vilka ROS eller en kombination av Ross är involverade i synnerhet patogenes processen. Resultaten från denna studie visar att med tillägg av väteperoxid en ökning av CM-H 2 DCFDA fluorescerar upptäcktes i förhållande till saltlösning kontroller, vilket tyder på att denna analys är ett värdefullt test för att upptäcka en oxidativ miljö inom G355-5 celler, en kattdjur astrocyternas cellinje.
Protocol
1. Cellkulturer av katt astrocyter och behandling med H 2 O 2
- Kultur cellinje G355-5 i en 75 cm 2-kolv med DMEM Media Plus näringsämnen vid 37 ° C och 5% CO 2 till 60% konfluenta (~ 5 dagar). Byt media varje 1-2 dagar eller som behövs för att upprätthålla en sund kultur.
- Ta bort media och tillsätt 2 ml 0,25% trypsin. Lyft cellerna genom att pipettera till 45 s - 1 min vid rumstemperatur (RT).
- Snabbt överföra suspensionen till ett 15 ml koniskt rör som innehåller 10 ml av media. Blanda försiktigt.
- Centrifugera vid 300 xg, 23 ° C i 3 min för att få en pellet. Kasta bort vätskefasen utan att störa pelleten.
- Tillsätt 6-7 ml färsk medier och återsuspendera cellerna.
- Tillsätt ~ 1 ml av celler till varje brunn i en 6-brunnar. Tillsätt 2-3 ml av media i varje brunn och inkubera tills 80-90% konfluenta.
- Förbered en 100μM lösning av väteperoxid (H 2 O 2) i media.
- Ta bort materialet från varje brunn och ersätt med antingen 2 ml färsk media (kontroll), 2 ml H 2 O 2 (behandling) eller 2 ml DPBS. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 för 3 timmar
- Ta bort lösningar och tillsätt 1 ml trypsin att lyfta cellerna. Överför celler till ett 1,7 ml Eppendorf-rör som innehåller 0,5 ml DPBS. Detta steg bör utföras på varje brunn individuellt för att förhindra celldöd från långvarig trypsin inkubation.
- Spin vid 300 xg under 3 min, kassera supernatanten och återsuspendera i 1 ml DPBS.
2. Färgning för ROS
- Alla steg för färgning bör utföras med minimal exponering för ljus för att förhindra blekning.
- Tillsätt 1 l på 50 mm CCCP att den positiva kontrollen. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 i 5 min.
- Tillsätt 5 ìl av en 10 mm CM-H 2 DCFDA lösning på H 2 O 2-gruppen. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 i 15-30 min. Inga fläckar läggs till i saltlösning provet.
- Tvätta prover med 2 ml DPBS att ta bort kvarvarande fläckar.
- Spin vid 300 xg under 3 min för att få en pellet.
- Resuspendera cellerna i 0,5 ml DPBS. Tillsätt 1 l PI till varje prov, utom koksaltlösning.
- Överför proverna till ett 5 ml flödescytometer rör.
- Kör på flödescytometern.
3. Flödescytometri
- Kör prov på ett Beckman Coulter FC500 (eller motsvarande) utrustad med en 488 nm argon laser och följande passerar band: 525, 775 och 620 nm, alla ± 20 nm.
- Förbered lämpliga kontroller: ofärgade celler, färgade CM-H 2 DCFDA bara, PI bara, dubbel färgade (negativ kontroll).
- Gör ett protokoll som har följande histoplots: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Det bör också ha följande histogram: cell nummer vs FL1, FL2 och FL3, vilket motsvarar fläckarna.
- Innan du kör proven, kontrollera utrustning, vätskor och avfallsbehållare. Värm upp den utrustning i minst 20 min.
- Rengör utrustning och utför en kalibrering med lämpliga pärlor enligt tillverkarens standard.
- Välj din protokoll och köra prover.
- Rengör utrustningen som gjorts tidigare.
- Rengör vakuum linjen enligt tillverkarens standard.
- Stäng av flödet och rengör huvudet / vakuum linje.
- Stäng av programmet och datorn.
4. Representativa resultat:
Flödescytometri Resultaten analyserades med hjälp FlowJo 7,6 och fläcken kontroller användes för att objektivt ställa in i gaten. Baserat på detta, friska celler visas till vänster i histogrammet och ROS (oxidativ stress) upptäcktes som en förskjutning av celler till höger. Figur 1 visar resultaten av effekten av väteperoxid på friska katt astrocyter. Data från FL1 användes för att mäta graden av CM-H 2 DCFDA, vilket indikerar förekomst av ROS. Som väntat var en högre andel ROS upptäcks i provet behandlas med H 2 O 2. Detta visas i histogrammet som en förskjutning i fluorescerande intensitet från vänster till höger. När man jämför friska celler som behandlats med DMEM kontra DPBS fanns det ingen betydande förändring i mängden ROS (Fig. 2).
Figur 1. Flödescytometri resultat av nivåer av oxidativ stress hos friska kattdjur astrocyter och effekten av H 2 O 2 på friska celler. Resultaten tyder på att H 2 O 2 ökar nivåerna av ROS i friska celler jämfört med celler utan behandling (DMEM).
Figur 2. Flödescytometrisystem resultat av nivåer av ROS upptäcks i friska celler inkuberas i 3 timmar med DPBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En ofta föreslagna mekanismen för att viruset orsakat neuronal skada är oxidativ stress 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. I grunden är det föreslås att genom viral exponering Glia (astrocyter och mikroglia) släpp reaktiva syreradikaler som, hydroxid, superoxid anjon, kväveoxid och / eller väteperoxid, som är giftiga för nervceller. Likaså har oxidativ stress också föreslagits som en viktig patologiska mekanism i metamfetamin-inducerad neurotoxicitet 2, 6, 17. Eftersom vår grupp är intresserad av effekterna av både virus och missbruksmedel på CNS, valde vi att använda en snabb screening test för att fastställa den nuvarande av överskjutande ROS i astrocyter. Majoriteten av neuronala glutation produceras av astrocyter och sedan levereras till nervceller 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30. Således är astrocyter roll för oxidativ stress viktiga för att upprätthålla en homeostatic miljö för nervceller samt att skydda nervceller från ROS, och är anledningen till att astrocyternas cellkulturer valdes för denna studie.
CM-H 2 DCFDA kallas även 2 ", 7'-dikloroflourosceinlösning och H2DCF. CM-H 2 DCFDA är en cell-genomsläpplig indikator för förekomst av reaktiva syreradikaler. CM-H 2 DCFDA in i cellen som ett icke-fluorescerande förening, som blir fluorescerande efter cellulära esteraser bort acetat grupper och föreningen blir oxideras. Väl inne i cellen och grupperna acetat tas bort, kan CM-H 2 DCFDA oxideras av ett antal ROS arter, inklusive kväveoxid, anjoner peroxynitrit, väteperoxid och organiska hydroperoxider 3, 14, 25, vilket resulterar i en grön fluorescerande produkt 23, 28. Denna brist på anger i ROS, som kan oxidera CM-H 2 DCFDA, gör det en värdefull reagens i ett tidigt skede av en patogenes undersökningen, i vilka en oxidativ stress Mekanismen tros spela en roll, men det är okänt vilket syreradikaler kan vara inblandade, snarare än test för varje ros för sig. När det har konstaterats att ROS är närvarande genom oxidation av CM-H 2 DCFDA, sedan ytterligare experiment kan utföras för att avgöra vilket ROS eller en kombination av Ross är involverade i synnerhet patogenes processen. Resultaten från denna studie visar att med tillägg av väteperoxid en ökning av CM-H 2 DCFDA fluorescerar upptäcktes jämfört med salinkontroll, vilket indikerar att denna analys är värdefullt test för att upptäcka en oxidativ miljö inom G355-5 celler, ett kattdjur astrocyternas cellinje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi tackar ReadiSorb Produkter för deras generösa stöd av dessa studier.
Acknowledgments
Vi tackar ReadiSorb Produkter för deras generösa stöd av dessa studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
- Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease. J Exp Med. 181, 735-745 (1995).
- Cadet, J. L., Ali, S., Epstein, C. Involvement of oxygen-based radicals in methamphetamine-induced neurotoxicity: evidence from the use of CuZnSOD transgenic mice. Ann N Y Acad Sci. 738, 388-3891 (1994).
- Cathcart, R., Schwiers, E., Ames, B. N. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay. Anal Biochem. 134, 111-116 (1983).
- Chao, C. C., Hu, S., Peterson, P. K. Glia: the not so innocent bystanders. J Neurovirol. 2, 234-239 (1996).
- Cooper, A. J., Kristal, B. S. Multiple roles of glutathione in the central nervous system. Biol Chem. 378, 793-802 (1997).
- Cubells, J. F., Rayport, S., Rajendran, G., Sulzer, D. Methamphetamine neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-dependent intracellular oxidative stress. J Neurosci. 14, 2260-2271 (1994).
- Dawson, V. L., Dawson, T. M., Uhl, G. R., Snyder, S. H. Human immunodeficiency virus type 1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric oxide in primary cortical cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 3256-329 (1993).
- Desagher, S., Glowinski, J., Premont, J. Astrocytes protect neurons from hydrogen peroxide toxicity. J Neurosci. 16, 2553-2562 (1996).
- Dewhurst, S., Gelbard, H. A., Fine, S. M.
- Dringen, R. Metabolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol. 62, 649-671 (2000).
- Dringen, R., Hamprecht, B. Glutathione restoration as indicator for cellular metabolism of astroglial cells. Dev Neurosci. 20, 401-407 (1998).
- Dringen, R., Pfeiffer, B., Hamprecht, B. Synthesis of the Antioxidant Glutathione in Neurons: Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for Neuronal Glutathione. J Neurosci. 19, 562-569 (1999).
- Everall, I. P. H. udson, L, R. W. K. erwin Decreased absolute levels of ascorbic acid and unaltered vasoactive intestinal polypeptide receptor binding in the frontal cortex in acquired immunodeficiency syndrome. Neurosci Lett. 224, 119-1122 (1997).
- Gabriel, C., Camins, A., Sureda, F. X., Aquirre, L., Escubedo, E., Pallas, M., Camarasa, J. Determination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diacetate and flow cytometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, 93-938 (1997).
- Gendelman, H. E., Genis, P., Jett, M., Zhai, Q. H., Nottet, H. S. An experimental model system for HIV-1-induced brain injury. Adv Neuroimmunol. 4, 189-1893 (1994).
- Hayman, M., Arbuthnott, G., Harkiss, G., Brace, H., Filippi, P., Philippon, V., Thomson, D., Vigne, R., Wright, A. Neurotoxicity of peptide analogues of the transactivating protein tat from Maedi-Visna virus and human immunodeficiency virus. Neuroscience. 53, 1-6 (1993).
- Hirata, H., Ladenheim, B., Rothman, R. B., Epstein, C., Cadet, J. L. Methamphetamine-induced serotonin neurotoxicity is mediated by superoxide radicals. Brain Res. , 677-6345 (1995).
- Koka, P., He, K., Zack, J. A., Kitchen, S., Peacock, W., Fried, I., Tran, T., Yashar, S. S., Merrill, J. E. Human immunodeficiency virus 1 envelope proteins induce interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide in glial cultures derived from fetal, neonatal, and adult human brain. J Exp Med. 182, 941-951 (1995).
- Kong, L. Y., Wilson, B. C., McMillian, M. K., Bing, G., Hudson, P. M., Hong, J. S. The effects of the HIV-1 envelope protein gp120 on the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines in mixed glial cell cultures. Cell Immunol. 172, 77-83 (1996).
- Koutsilieri, E., Gotz, M. E., Sopper, S., Sauer, U., Demuth, M., ter Meulen, V., Riederer, P. Regulation of glutathione and cell toxicity following exposure to neurotropic substances and human immunodeficiency virus-1 in vitro. J Neurovirol. 3, 342-349 (1997).
- Lipton, S. A. Similarity of neuronal cell injury and death in AIDS dementia and focal cerebral ischemia: potential treatment with NMDA open-channel blockers and nitric oxide-related species. Brain Pathol. 6, 507-517 (1996).
- Lipton, S. A., Yeh, M., Dreyer, E. B. Update on current models of HIV-related neuronal injury: platelet-activating factor, arachidonic acid and nitric oxide. Adv Neuroimmunol. 4, 181-188 (1994).
- Mills, E. M., Takeda, K., Yu, Z. X., Ferrans, V., Katagiri, Y., Jiang, H., Lavigne, M. C., Leto, T. L., Guroff, G. Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells. J Biol Chem. 273, 22165-22168 (1998).
- Peuchen, S., Duchen, M. R., Clark, J. B. Modulation of the glutathione redox state in adult astrocytes. Biochem Soc Trans. 24, 449S-449S (1996).
- Possel, H., Noack, H., Augustin, W., Keilhoff, G., Wolf, G. 2,7-Dihydrodichlorofluorescein diacetate as a fluorescent marker for peroxynitrite formation. FEBS Lett. 416, 175-178 (1997).
- Sagara, J., Makino, N., Bannai, S. Glutathione efflux from cultured astrocytes. J Neurochem. 66, 1876-1881 (1996).
- Stefano, G. B., Smith, E. M., Paemen, L. R., Hughes, T. K. Jr HIV gp120 associated neurological deficits: a potential role for nitric oxide and other signal molecules. Advances in Neuroimmunology. 3, 47-57 (1993).
- Sundaresan, M., Yu, Z. X., Ferrans, V. J., Irani, K., Finkel, T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. 270, 296-299 (1995).
- Wang, X. F., Cynader, M. S. Astrocytes provide cysteine to neurons by releasing glutathione. J Neurochem. 74, 1434-1442 (2000).
- Wilson, J. X. Antioxidant defense of the brain: a role for astrocytes. Can J Physiol Pharmacol. 75, 1149-1163 (1997).
- Zenger, E., Collisson, E. W., Barhoumi, R., Burghardt, R. C., Danave, I. R., Tiffany-Castiglioni, E. Laser cytometric analysis of FIV-induced injury in astroglia. Glia. 13, 92-100 (1995).
