Summary
एक स्क्रीनिंग विधि करने के लिए oxidative सेलुलर वातावरण का पता लगाने के लिए मुख्यमंत्री के H2DCFDA के ऑक्सीकरण को मापने है. गैर फ्लोरोसेंट से एक फ्लोरोसेंट परिसर में एक बार एक सेल, मुख्यमंत्री-H2DCFDA परिवर्तन के भीतर ऑक्सीकरण. प्रतिदीप्ति में यह परिवर्तन प्रवाह cytometry द्वारा मापा जाता है और oxidative वातावरण में कक्षों की संख्या इंगित करता है.
Abstract
वायरस का एक अक्सर सुझाव दिया तंत्र neuronal नुकसान प्रेरित oxidative तनाव है. Astrocytes केन्द्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) की oxidative तनाव को नियंत्रित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका है. Astrocytes मदद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) से न्यूरॉन्स की रक्षा न्यूरॉन्स के लिए एक homeostatic वातावरण बनाए रखने. मुख्यमंत्री-H2DCFDA ROS की उपस्थिति के लिए एक सेल पारगम्य सूचक है. मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA गैर फ्लोरोसेंट एक यौगिक के रूप में सेल में प्रवेश करती है, और बाद सेलुलर esterases एसीटेट समूहों को निकालने के फ्लोरोसेंट हो जाता है, और मिश्रित ऑक्सीकरण है. कोशिकाओं, प्रवाह cytometry द्वारा मापा, कि हरी fluorescing होना पाया जाता है की संख्या कोशिकाओं है कि एक oxidative राज्य में कर रहे हैं की संख्या का एक संकेत है. मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA अलग ROS की एक बड़ी संख्या के द्वारा ऑक्सीकरण करने के लिए अतिसंवेदनशील है . विशिष्टता की इस कमी के बारे में जो ROS के मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA oxidize सकते हैं, इस परिसर में एक रोगजनन जांच के प्रारंभिक चरणों में उपयोग के लिए मूल्यवान रीजेंट बनाता है, इस परख के रूप में एक oxidative सेलुलर पर्यावरण के लिए स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है ऑक्सीजन जो परवाह किए बिना इस्तेमाल किया कट्टरपंथी या ROS के संयोजन सेलुलर स्थितियों के लिए जिम्मेदार हैं. एक बार जब यह स्थापित किया गया है कि ROS मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA के ऑक्सीकरण से मौजूद है, तो अतिरिक्त प्रयोगों जो ROS या रॉस के संयोजन विशेष रोगजनन प्रक्रिया में शामिल कर रहे हैं निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है है. इस अध्ययन के परिणामों को दिखाना है कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA में वृद्धि के अलावा के साथ खारा नियंत्रण के सापेक्ष था पता चला प्रतिदीप्ति, यह दर्शाता है कि इस परख G355-5 कोशिकाओं के भीतर एक oxidative वातावरण का पता लगाने के लिए एक मूल्यवान परीक्षण, एक बिल्ली के समान astrocyte सेल लाइन.
Protocol
1. बिल्ली के समान astrocytes के सेल संस्कृति और एच 2 2 हे के साथ इलाज
- संस्कृति 37 पर एक 75 सेमी 2 DMEM मीडिया अधिक पोषक तत्वों के साथ फ्लास्क में सेल लाइन G355 5 डिग्री सेल्सियस और 5% 60% मिला हुआ (~ 5 दिन) तक सीओ 2. मीडिया बदलें हर 1-2 दिन या के रूप में एक स्वस्थ संस्कृति को बनाए रखने की जरूरत है.
- मीडिया निकालें और 0.25% की trypsin के 2 मिलीलीटर जोड़ने. 45 s के लिए pipetting द्वारा कोशिकाओं लिफ्ट - कमरे के तापमान (आर टी) पर 1 मिनट.
- जल्दी से एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार मीडिया के 10 मिलीलीटर युक्त ट्यूब निलंबन हस्तांतरण. धीरे मिश्रण.
- 3 मिनट के लिए 300 XG, 23 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र एक गोली प्राप्त है. गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
- ताजा मीडिया के 6-7 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं resuspend.
- 6 अच्छी तरह से एक थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ~ कक्षों की एक मिलीलीटर जोड़ें. एक अच्छी तरह से मीडिया के 2-3 मिलीलीटर जोड़ें और 80-90% मिला हुआ जब तक सेते हैं.
- मीडिया में पेरोक्साइड के एक 100μM समाधान (2 एच ओ 2) तैयार करें.
- प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया निकालें और या तो 2 मिलीलीटर ताजा (नियंत्रण) मीडिया, एच 2 2 हे (उपचार) या DPBS के 2ml के 2 मिलीलीटर के साथ बदलें . 3 एच. के लिए °% 5 सी, सीओ 2 37 में सेते
- समाधान निकालें और trypsin के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए कोशिकाओं लिफ्ट. 1.7 मिलीलीटर Eppendorf 0.5 मिलीलीटर DPBS युक्त ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण. इस कदम पर प्रत्येक अच्छी तरह से व्यक्तिगत प्रदर्शन किया जाना चाहिए क्रम में करने के लिए लंबे समय तक trypsin ऊष्मायन से कोशिका मृत्यु को रोकने के है.
- 3 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन त्यागें, सतह पर तैरनेवाला और DPBS के 1 मिलीलीटर में resuspend.
2. ROS के लिए धुंधला हो जाना
- न्यूनतम प्रकाश विरंजन रोकने के जोखिम के साथ धुंधला के लिए सभी कदम बाहर किया जाना चाहिए.
- सकारात्मक नियंत्रित करने के लिए 50 मिमी CCCP 1 μl जोड़ें. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस, 5% 5 मिनट के लिए सीओ 2 .
- एक 10 मिमी मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA एच 2 हे 2 समूह के लिए समाधान के 5 μl जोड़ें. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस, 5% 15-30 मिनट के लिए सीओ 2. कोई दाग खारा नमूना में जोड़ा जाता है.
- DPBS के 2 मिलीग्राम के साथ नमूने धो अवशिष्ट दाग को दूर.
- 3 मिनट के लिए 300 XG पर स्पिन के लिए एक गोली प्राप्त.
- DPBS की 0.5 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend. प्रत्येक नमूना के लिए खारा छोड़कर 1 μl PI, जोड़ें.
- एक 5ml प्रवाह cytometer ट्यूब नमूने स्थानांतरण.
- प्रवाह cytometer पर चलाएँ.
3. प्रवाह cytometry
- 525, 775 और 620 एनएम, सभी 20 एनएम ±: एक के Beckman कल्टर (या समतुल्य) FC500 के साथ एक 488 एनएम argon लेजर और निम्नलिखित बैंड गुजरता सुसज्जित नमूने चलाएँ.
- उचित नियंत्रण की तैयारी: बेदाग कोशिकाओं, मुख्यमंत्री - एच 2 DCFDA ही दाग, पीआई ही, डबल दाग (नकारात्मक नियंत्रण).
- एफएस बनाम एस एस, पीआई बनाम मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA: एक प्रोटोकॉल है कि निम्नलिखित histoplots है. यह भी निम्नलिखित histograms होनी चाहिए: सेल नंबर बनाम FL2 FL1, और FL3, जो दाग के लिए मेल खाती है.
- नमूने को चलाने से पहले, उपकरण, तरल पदार्थ, और अपशिष्ट कंटेनर की जाँच करें. कम से कम 20 मिनट के लिए गर्म उपकरण.
- यंत्र स्वच्छ और निर्माताओं के मानकों के अनुसार उपयुक्त मोतियों के साथ एक अंशांकन प्रदर्शन.
- अपने प्रोटोकॉल का चयन करें और नमूने को चलाने के.
- उपकरण साफ के रूप में पहले से किया.
- साफ़ निर्वात लाइन निर्माताओं के मानकों के अनुसार.
- बंद प्रवाह मुड़ें और सिर / निर्वात लाइन साफ है.
- सॉफ्टवेयर और कंप्यूटर बंद करें.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
प्रवाह cytometry परिणामों FlowJo 7.6 और दाग को नियंत्रित करने के लिए निष्पक्ष gating सेट करने के लिए इस्तेमाल किया गया विश्लेषण का उपयोग कर रहे थे. इस के आधार पर, स्वस्थ कोशिकाओं हिस्टोग्राम और ROS (oxidative तनाव) की बाईं तरफ के दिखाई देते हैं सही करने के लिए कक्षों की एक बदलाव के रूप में खोजा गया था. चित्रा 1 स्वस्थ बिल्ली के समान astrocytes पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के प्रभाव के परिणाम से पता चलता है. FL1 से डेटा के मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA, जो ROS की उपस्थिति का संकेत की तीव्रता को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था. जैसी उम्मीद थी, ROS के एक उच्च राशि एच 2 2 हे के साथ इलाज के नमूने में पाया गया. यह फ्लोरोसेंट तीव्रता में एक बदलाव के रूप में बाएँ से दाएँ हिस्टोग्राम पर प्रदर्शित होता है. जब DMEM बनाम DPBS के साथ इलाज स्वस्थ कोशिकाओं की तुलना ROS (चित्र 2) की राशि में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन किया गया था.
चित्रा स्वस्थ बिल्ली के समान astrocytes में oxidative तनाव के स्तर और स्वस्थ कोशिकाओं पर 2 एच ओ 2 के प्रभाव के 1. प्रवाह cytometry परिणाम. परिणामों से संकेत मिलता है कि एच 2 2 हे स्वस्थ कोशिकाओं में ROS के स्तर बढ़ता है के रूप में कोई इलाज (DMEM) के साथ कोशिकाओं की तुलना में.
चित्रा 2. ROS के स्तर स्वस्थ DPBS साथ 3hrs के लिए incubated कोशिकाओं में पाया फ्लो Cytometry परिणाम.
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Discussion
वायरस का एक बार सुझाव दिया तंत्र प्रेरित neuronal नुकसान oxidative तनाव 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31 है. असल में, यह प्रस्ताव है कि वायरल प्रदर्शन के माध्यम से जैसे, हीड्राकसीड, superoxide आयनों, नाइट्रिक ऑक्साइड और / या हाइड्रोजन पेरोक्साइड, जो न्यूरॉन्स के लिए विषाक्त कर रहे हैं glia (astrocytes और microglia) रिलीज प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन कण. इसी तरह, oxidative तनाव भी methamphetamine प्रेरित neurotoxicity 2, 6, 17 में एक प्रमुख वैकृत तंत्र के रूप में सुझाव दिया गया है . के बाद से हमारे समूह सीएनएस पर दुरुपयोग के वायरस दोनों दवाओं के प्रभाव में रुचि है, हम एक त्वरित स्क्रीनिंग परीक्षा का उपयोग करने के लिए astrocytes में अतिरिक्त ROS के वर्तमान निर्धारित निर्वाचित. neuronal glutathione का बहुमत astrocytes द्वारा निर्मित है और फिर न्यूरॉन्स 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30 के लिए दिया है . इस प्रकार, oxidative तनाव में astrocytes भूमिका न्यूरॉन्स के लिए एक homeostatic पर्यावरण को बनाए रखने के रूप में अच्छी तरह के रूप में ROS से न्यूरॉन्स की रक्षा में महत्वपूर्ण है, और कारण है कि astrocyte सेल संस्कृतियों इस अध्ययन के लिए चुना गया है.
मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA भी 2 ', 7'dichlorofluorescein और H2DCF के रूप में जाना जाता है. मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की उपस्थिति के लिए एक सेल पारगम्य सूचक है . मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA गैर फ्लोरोसेंट एक यौगिक है, जो फ्लोरोसेंट हो जाता है के बाद सेलुलर esterases एसीटेट समूहों को निकालने के रूप सेल में प्रवेश करती है, और मिश्रित ऑक्सीकरण हो जाता है. एक बार सेल और एसीटेट समूहों के अंदर हटा रहे हैं, मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA ROS प्रजातियों में से एक संख्या से ऑक्सीकरण किया जा सकता है, नाइट्रिक ऑक्साइड, peroxynitrite anions, हाइड्रोजन पेरोक्साइड, और जैविक hydroperoxides 3, 14, 25 सहित, एक हरे रंग की में जिसके परिणामस्वरूप फ्लोरोसेंट उत्पाद 23, 28. इस कमी की ROS में निर्दिष्ट करते हैं, जो मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA oxidize सकते हैं, यह एक रोगजनन जांच, जिसमें एक oxidative तनाव तंत्र के लिए एक भूमिका निभा माना जा रहा है के प्रारंभिक दौर में एक मूल्यवान अभिकर्मक बनाता है, लेकिन यह अज्ञात है जो कट्टरपंथी ऑक्सीजन शामिल बजाय प्रत्येक ROS के लिए अलग से परीक्षण हो सकता है. एक बार जब यह स्थापित किया गया है कि ROS मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA, तो अतिरिक्त प्रयोगों के लिए निर्धारित किया जा सकता है, जो ROS या रॉस के संयोजन विशेष रोगजनन प्रक्रिया में शामिल कर रहे हैं के ऑक्सीकरण से मौजूद हैं. इस वर्तमान अध्ययन के परिणाम दर्शाते हैं कि हाइड्रोजन पेरोक्साइड मुख्यमंत्री एच 2 DCFDA में वृद्धि के अलावा के साथ पाया गया था प्रतिदीप्ति जब खारा नियंत्रण की तुलना में, यह दर्शाता है कि कि इस परख G355-5 के भीतर एक oxidative पर्यावरण का पता लगाने के लिए मूल्यवान परीक्षण है कोशिकाओं, एक बिल्ली के समान astrocyte सेल लाइन.
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Disclosures
हम इन अध्ययनों के अपने उदार सहायता के लिए ReadiSorb उत्पाद को धन्यवाद.
Acknowledgments
हम इन अध्ययनों के अपने उदार सहायता के लिए ReadiSorb उत्पाद को धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
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