Summary
酸化的細胞の環境を検出するスクリーニング法は、CM - H2DCFDAの酸化を測定することです。かつて非蛍光からの蛍光化合物に細胞、CM - H2DCFDA変化の中で酸化する。蛍光の変化はフローサイトメトリーで測定し、酸化的環境における細胞の数を示しています。
Abstract
神経損傷を誘発したウイルスの多くの場合、提案されたメカニズムは、酸化ストレスです。星状膠細胞は、中枢神経系（CNS）の酸化ストレスの制御に重要な役割を担っている。星状膠細胞は、活性酸素種（ROS）から神経細胞を保護するだけでなく、神経細胞のための恒常的な環境を維持するのに役立ちます。 CM - H2DCFDAは、ROSの存在のための細胞透過性の指標です。 CM - H 2 DCFDAは非蛍光化合物として細胞に入り、そして細胞のエステラーゼが酢酸基を除去した後、蛍光灯になり、そして化合物が酸化される。緑色の蛍光であることが判明しているフローサイトメトリーによって測定された細胞の数は、、酸化状態にある細胞の数を示しています。 CM - H 2 DCFDAは異なるROSの多数による酸化を受けやすくなります。このアッセイは関係なく、酸素の酸化的細胞環境のために画面に使用できるようにROSがCM - H 2 DCFDAを酸化させることができるかに関する特異性の欠如は、、、この化合物病因調査の初期段階で使用するための貴重な摂政ですラジカルやROSの組み合わせは、細胞の条件のための責任があります。それは、ROSがCM - H 2 DCFDAの酸化によって存在することが確立されると、その後の追加実験がROSやロスの組み合わせが特定の病因のプロセスに関係しているかを判定するために実施することができます。この研究の結果は、過酸化水素の添加によりCM - H 2 DCFDAの増加はこのアッセイは、G355 - 5細胞内酸化的環境を検出するための貴重なテストであることを示す、生理食塩水対照と比較して検出された蛍光を発することを示しているネコのアストロサイト細胞株。
Protocol
1。セルの猫アストロサイトの培養およびH 2 O 2による治療
- 37 DMEMのメディアに加え、栄養素が75 cm 2のフラスコでの培養細胞株G355 - 5℃、5％CO 2 60％コンフルエント（〜5日）まで。すべての1〜2日メディアを交換するかなど、健全な文化を維持するために必要。
- メディアを取り出して、0.25％トリプシン液2 mlを加える。 45秒のためにピペッティングして細胞を持ち上げ - 室温で1分（RT）。
- すぐにメディアの10mlを含む15mlコニカルチューブに懸濁液を移す。穏やかに混合する。
- ペレットを得るために3分間採り、300 xg、23℃で遠心する。ペレットが剥がれないように上清を捨てる。
- 新鮮な培地6〜7 mlを加え、細胞を懸濁します。
- 6ウェルプレートの各ウェルに細胞を約1 mlを加え。各ウェルにメディア2〜3 mlを加え80〜90％コンフルエントになるまでインキュベートする。
- メディアの過酸化物の100μM溶液（H 2 O 2）を準備する。
- 各ウェルから培地を取り除き、どちらかの2ミリリットル新鮮な培地（コントロール）、H 2 O 2（治療）またはDPBSの2ミリリットルの2mlで交換してください。 37℃で3時間C、5％CO 2を
- ソリューションを削除し、細胞を持ち上げるためにトリプシン液1 mlを加える。 0.5 mlのDPBSを含む1.7ミリリットルのエッペンドルフチューブに細胞を移す。このステップは、長時間のトリプシンのインキュベーションから細胞死を防ぐために、各ウェルを個別に実行する必要があります。
- 3分間、300 xgでスピン、上清とDPBS 1mlに再懸濁しますを破棄。
2。 ROSの染色
- 染色のためのすべてのステップは、漂白防ぐために最小限の光露光を用いて実施されるべきである。
- 陽性対照に、50mMのCCCPの1μlを追加します。 37℃、5分間、5％CO 2を 。
- H 2 O 2グループに10mMのCM - H 2 DCFDAの溶液5μlを添加します。 37℃、15〜30分間、5％CO 2を 。いいえ汚れは、生理食塩水のサンプルに追加されません。
- 残留汚れを除去するDPBS 2mlでサンプルを洗浄してください。
- ペレットを得るために3分間、300 xgでスピン。
- DPBS 0.5 mlに細胞を再懸濁します。生理食塩水を除いて、各サンプルに1μlのPIを追加。
- 5ミリリットルフローサイトメーターのチューブにサンプルを移す。
- フローサイトメーターで実行する。
3。フローサイトメトリー
- 525、775および620nmの、すべての± 20 nmの：488 nmのアルゴンレーザーと、次のバンドパスを装備したベックマンコールター社FC500（または同等の）上のサンプルを実行します。
- 適切なコントロールを準備：未染色の細胞を、CM - H 2 DCFDAは（ネガティブコントロール）PIのみ、二重染色した、唯一の染色。
- FS対SS、PI対CM - H 2 DCFDA：以下histoplotsを持つプロトコルを行います。汚れに対応するFL1、FL2およびFL3対細胞数、：それはまた、以下のヒストグラムを持つ必要があります。
- サンプルを実行する前に、機器、液体や廃棄物のコンテナをチェックしてください。少なくとも20分間、機器のウォームアップを行います。
- 機械を洗浄し、メーカーの基準に従って適切なビーズを使用したキャリブレーションを実行します。
- あなたのプロトコルを選択して、サンプルを実行する。
- 以前に行ったとして機械を洗浄してください。
- メーカーの規格に従って真空ラインを清掃してください。
- 流をオフにし、ヘッド/真空ラインをきれいに。
- ソフトウェアおよびコンピュータの電源を切ります。
4。代表的な結果：
フローサイトメトリーの結果はFlowJo 7.6および染色コントロールを使用して分析した客観的にゲートを設定するために使用された。これに基づいて、健康な細胞は、ヒストグラムの左側に表示され、ROSが（酸化ストレス）右のセルのシフトとして検出された。図1は、健康なネコのアストロサイトでの過酸化水素の効果の結果を示しています。 FL1からのデータは、ROSの存在を示すCM - H 2 DCFDA、強度を測定するために使用されていました。予想通り、ROSの高い量は、H 2 O 2で処理された試料で検出された。これは、左から右への蛍光強度の変化としてヒストグラムに表示されます。 DMEM対DPBSで治療健康な細胞を比較する際に、ROSの量（図2）には有意な変化はなかった。
健康な猫のアストロサイトにおける酸化ストレスのレベルと健康な細胞のH 2 O 2の影響の図1。フローサイトメトリーの結果。結果は、無治療（DMEM）を持つ細胞と比較してH 2 O 2は、健康な細胞内ROSレベルを増加させることを示している。
DPBSで3時間インキュベート健康な細胞で検出されたROSのレベルの図2。フローサイトメトリーの結果。
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Discussion
神経損傷を誘発したウイルスの多くの場合、提案されたメカニズムは、酸化ストレス1、4、7、9、13、15、16、18-22、27、31です。基本的に、それが神経細胞に有毒であるなどの水酸化物、スーパーオキシドアニオン、一酸化窒素、および/または過酸化水素、などのウイルス暴露によるグリア細胞（アストロサイトとミクログリア）放出、活性酸素ラジカル、ことが提案されている。同様に、酸化ストレスはまた、メタンフェタミン誘発性神経毒性2、6、17の主要な病理学的メカニズムとして提案されている。私たちのグループはCNSの悪用のウイルスと薬の両方の効果に興味を持っているので、我々は、星状膠細胞の過剰活性酸素の存在を決定するために迅速なスクリーニングテストを使用することを選択。神経グルタチオンの大部分はアストロサイトで産生され、その後ニューロン5、8、10-12、24、26、29、30に配信されます。従って、酸化ストレスのアストロサイトの役割は、ニューロンのための恒常的な環境を維持するだけでなく、ROSからニューロンを保護する上で重要であり、アストロサイト細胞培養がこの研究のために選ばれたことが理由です。
CM - H 2 DCFDAも2'、7' -ジクロロフルオレセインとH2DCFとして知られています。 CM - H 2 DCFDAは、活性酸素種の存在のための細胞透過性の指標です。 CM - H 2 DCFDAは、細胞エステラーゼが酢酸基を除去した後、蛍光灯になると非蛍光化合物として細胞に入り、そして化合物が酸化となる。いったん細胞とアセテート基の内部に削除される、CM - H 2 DCFDAは緑色で、その結果、一酸化窒素、ペルオキシナイトライトの陰イオン、過酸化水素、及び有機ヒドロペルオキシド3、14、25を含めて、ROSの種の数によって酸化することができます蛍光生成物23、28。 CM - H 2 DCFDAを酸化できるROSで指定の欠如は、酸化ストレスのメカニズムが役割を果たすことと考えられている、その病因の捜査の初期段階での貴重な試薬ですが、それはどの不明です酸素ラジカルは、むしろ各ROS別々のテストではなく、関与するかもしれない。それは、ROSがCM - H 2 DCFDAの酸化によって存在することが確立されると、その後の追加実験がROSやロスの組み合わせが特定の病因のプロセスに関与している、決定するために実行することができます。生理食塩水対照と比較すると、この本研究の結果、過酸化水素のほかにCM - H 2 DCFDAの増加が蛍光を発することを示しているが、このアッセイは、G355 - 5内で酸化的環境を検出するための貴重なテストであることを示し、検出された細胞、ネコアストロサイト細胞株。
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Disclosures
我々はこれらの研究への惜しみない支援のためのReadiSorb製品に感謝。
Acknowledgments
我々はこれらの研究への惜しみない支援のためのReadiSorb製品に感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
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