Summary
Un metodo di screening per individuare gli ambienti ossidativo cellulare è quello di misurare l'ossidazione delle CM-H2DCFDA. Una volta ossidato all'interno di una cella di CM-H2DCFDA cambiamenti da non fluorescente in un composto fluorescente. Questo cambiamento di fluorescenza viene misurata mediante citometria di flusso e indica il numero di cellule in un ambiente ossidativo.
Abstract
Un meccanismo spesso suggerito di virus danno neuronale indotto è lo stress ossidativo. Astrociti svolgono un ruolo importante nel controllo dello stress ossidativo del Sistema Nervoso Centrale (SNC). Astrociti aiutare a mantenere un ambiente omeostatico per i neuroni così come proteggere i neuroni da specie reattive dell'ossigeno (ROS). CM-H2DCFDA è una cellula-permeabile indicatore per la presenza di ROS. CM-H 2 DCFDA entra nella cellula come un non-fluorescenti composte, e diventa fluorescente dopo esterasi cellulari rimuovere i gruppi di acetato, e il composto viene ossidato. Il numero di cellule, misurato mediante citometria di flusso, che si trovano ad essere fluorescente verde è l'indicazione del numero di cellule che sono in uno stato ossidativo. CM-H 2 DCFDA è suscettibile di ossidazione da un gran numero di differenti ROS. Questa mancanza di specificità, per i quali ROS possono ossidare CM-H 2 DCFDA, rende questo composto un reggente prezioso per l'utilizzo nelle prime fasi di un'indagine patogenesi, in quanto questo test può essere usato per individuare un ambiente ossidativo cellulare, indipendentemente da quale ossigeno radicale o la combinazione di ROS sono responsabili per le condizioni di cellulare. Una volta stabilito che i ROS sono presenti dall'ossidazione di CM-H 2 DCFDA, poi ulteriori esperimenti possono essere eseguiti per determinare quale ROS o combinazione di Ross sono coinvolti nel processo di patogenesi particolare. I risultati di questo studio dimostrano che con l'aggiunta di perossido di idrogeno, un aumento della CM-H 2 DCFDA fluorescenza è stato rilevato rispetto ai controlli salina, indicando che questo test è un test importante per la rilevazione di un ambiente ossidativo all'interno G355-5 celle, un felina linea cellulare astrociti.
Protocol
1. Colture cellulari di astrociti felino e il trattamento con H 2 O 2
- Linea cellulare cultura G355-5 in un centimetro 75 2 pallone con i media DMEM più nutrienti a 37 ° C e 5% di CO 2 fino al 60% confluenti (~ 5 giorni). Sostituire i media ogni 1-2 giorni o secondo necessità per mantenere una sana cultura.
- Rimuovere i supporti e aggiungere 2 ml di tripsina 0,25%. Sollevare le cellule pipettando per 45 s - 1 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Trasferire rapidamente la sospensione in un tubo da 15 ml contenente 10 ml di media. Mescolare delicatamente.
- Centrifugare a 300 xg, 23 ° C per 3 minuti per ottenere un pellet. Scartare il sopranatante senza disturbare il pellet.
- Aggiungere 6-7 ml di mezzi freschi e risospendere le cellule.
- Aggiungi ~ 1 ml di cellule in ogni pozzetto di un 6-pozzetti. Aggiungere 2-3 ml di media per ciascun pozzetto e incubare fino al 80-90% confluenti.
- Preparare una soluzione 100μM di perossido (H 2 O 2) in media.
- Rimuovere i supporti di ogni bene e sostituirlo con 2 ml di mezzi freschi (di controllo), 2 ml di H 2 O 2 (trattamento) o 2 ml di DPBS. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 3 ore
- Rimuovere soluzioni e aggiungere 1 ml di tripsina per sollevare le cellule. Trasferire le cellule in una provetta da 1,7 ml Eppendorf contenente 0,5 ml DPBS. Questa operazione deve essere eseguita su ogni bene singolarmente al fine di prevenire la morte cellulare di incubazione tripsina prolungato.
- Spin a 300 xg per 3 minuti, scartare il surnatante e risospendere in 1 ml di DPBS.
2. Colorazione per ROS
- Tutti i passaggi per la colorazione deve essere effettuata con un minimo l'esposizione alla luce per evitare l'imbiancamento.
- Aggiungere 1 ml di 50 mM CCCP per il controllo positivo. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 5 min.
- Aggiungere 5 ml di 10 mm CM-H 2 soluzione DCFDA per l'H 2 O 2 gruppi. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 15-30 min. Nessuna macchia è aggiunto al campione salina.
- Lavare i campioni con 2 ml di DPBS per rimuovere macchie residue.
- Spin a 300 xg per 3 minuti per ottenere un pellet.
- Risospendere le cellule in 0,5 ml di DPBS. Aggiungere 1 PI microlitri di ciascun campione, ad eccezione della soluzione salina.
- Trasferire i campioni in una provetta da 5 ml citofluorimetro.
- Esegui il citofluorimetro.
3. Citometria a flusso
- Esegui campioni su un Beckman Coulter FC500 (o equivalente) dotato di un laser ad argon 488 nm e la passa banda seguenti: 525, 775 e 620 nm, tutti ± 20 nm.
- Preparare i controlli del caso: le cellule senza macchia, CM-H 2 DCFDA colorato solo, solo PI, macchiato doppio (controllo negativo).
- Fai un protocollo che ha il histoplots seguenti: FS vs SS, PI vs CM-H 2 DCFDA. Si dovrebbero inoltre avere la istogrammi seguenti: numero di cellulare vs FL1, FL2 e FL3, che corrisponde alle macchie.
- Prima di eseguire i campioni, controllare le attrezzature, fluidi e contenitore per rifiuti. Riscaldare il materiale per almeno 20 min.
- Pulire le attrezzature e effettuare una calibrazione con le perline appropriato secondo le norme produttori.
- Selezionare il protocollo ed eseguire gli esempi.
- Pulire l'apparecchiatura come fatto in precedenza.
- Pulire la linea del vuoto secondo le norme produttori.
- Spegnere il flusso e pulire la testina / vuoto linea.
- Disattivare il software e il computer.
4. Rappresentante dei risultati:
Risultati di citometria a flusso sono stati analizzati utilizzando FlowJo 7.6 e controlli macchia sono stati utilizzati per impostare oggettivamente gating. Sulla base di questo, le cellule sane appaiono sulla sinistra dell'istogramma e ROS (stress ossidativo) è stato rilevato come uno spostamento di celle a destra. La Figura 1 mostra i risultati degli effetti del perossido di idrogeno a salutare astrociti felino. I dati di FL1 è stato utilizzato per misurare l'intensità di CM-H 2 DCFDA, che indica la presenza di ROS. Come previsto, una maggiore quantità di ROS è stata rilevata nel campione trattato con H 2 O 2. Questo viene visualizzato l'istogramma come un cambiamento di intensità fluorescente da sinistra a destra. Quando si confrontano le cellule sane trattate con DMEM contro DPBS, non c'era nessun cambiamento significativo nella quantità di ROS (Fig. 2).
Figura 1. Citometria a flusso risultati dei livelli di stress ossidativo in soggetti sani astrociti felino e l'effetto di H 2 O 2 sulle cellule sane. I risultati indicano che H 2 O 2 aumenta i livelli di ROS nelle cellule sane rispetto alle cellule con nessun trattamento (DMEM).
Figura 2. Citometria a flusso risultati dei livelli di ROS rilevato nelle cellule sane incubate per 3 ore con DPBS.
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Discussion
Un meccanismo spesso suggerito di virus danno neuronale indotto è lo stress ossidativo 1, 4, 7, 9, 13, 15, 16, 18-22, 27, 31. In sostanza, si propone che attraverso l'esposizione virale della glia (astrociti e microglia) radicali rilasciano ossigeno reattive come, idrossido, anione superossido, ossido nitrico, e / o perossido di idrogeno, che sono tossici per i neuroni. Allo stesso modo, lo stress ossidativo è stato anche suggerito come un importante meccanismo patologico in metanfetamine neurotossicità indotta da 2, 6, 17. Poiché il nostro gruppo è interessato agli effetti di entrambi i virus e le droghe d'abuso sul sistema nervoso centrale, abbiamo deciso di utilizzare un test rapido di screening per determinare l'attuale eccesso di ROS negli astrociti. La maggior parte di glutatione neuronale è prodotto dalla astrociti e poi consegnato ai neuroni 5, 8, 10-12, 24, 26, 29, 30. Pertanto, il ruolo dello stress ossidativo astrociti è importante per mantenere un ambiente omeostatico per i neuroni così come protegge i neuroni da ROS, ed è la ragione che le colture cellulari astrociti sono stati scelti per questo studio.
CM-H 2 DCFDA è anche conosciuto come 2 ', 7'-diclorofluoresceina e H2DCF. CM-H 2 DCFDA è una cellula-permeabile indicatore per la presenza di specie reattive dell'ossigeno. CM-H 2 DCFDA entra nella cellula come un non-composto fluorescente, che diventa fluorescente dopo esterasi cellulari rimuovere i gruppi di acetato, e il composto diventa ossidato. Una volta all'interno della cellula e dei gruppi di acetato vengono rimossi, il CM-H 2 DCFDA può essere ossidato da un certo numero di specie ROS, tra cui l'ossido nitrico, il perossinitrito anioni, perossido di idrogeno, idroperossidi organici e 3, 14, 25, risultando in un verde fluorescenti prodotto 23, 28. Questa mancanza di specificare nel ROS, in grado di ossidare CM-H 2 DCFDA, lo rende un reagente utile nelle prime fasi di un'indagine patogenesi, in cui si crede un meccanismo di stress ossidativo di giocare un ruolo, ma non si sa che ossigeno radicale potrebbe essere coinvolto, invece di test per ogni separatamente ROS. Una volta stabilito che i ROS sono presenti dall'ossidazione di CM-H 2 DCFDA, poi ulteriori esperimenti possono essere eseguiti per determinare, che sono coinvolti ROS o combinazione di Ross nel processo di patogenesi particolare. I risultati di questo studio dimostrano che con l'aggiunta di perossido di idrogeno, un aumento della CM-H 2 DCFDA fluorescenza è stato rilevato rispetto al controllo con soluzione salina, indicando che questo saggio è di prova importante per la rilevazione di un ambiente ossidativo all'interno della G355-5 celle, una cella felino linea astrociti.
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Disclosures
Ringraziamo Prodotti ReadiSorb per il loro generoso sostegno di questi studi.
Acknowledgments
Ringraziamo Prodotti ReadiSorb per il loro generoso sostegno di questi studi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
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