Summary
وهناك طريقة الفحص للكشف عن البيئات الخلوية الاكسدة هو قياس أكسدة CM - H2DCFDA. تتأكسد مرة واحدة داخل الخلية التغييرات CM - H2DCFDA ، من غير الفلورية في مجمع الفلورسنت. ويقاس هذا التغيير في مضان بواسطة التدفق الخلوي ، ويشير إلى عدد من الخلايا في بيئة الأكسدة.
Abstract
آلية غالبا ما اقترح من الفيروس الخلايا العصبية التي يسببها الضرر هو الاكسدة. النجمية لها دور هام في السيطرة على الاكسدة من الجهاز العصبي المركزي (CNS). النجمية مساعدة في الحفاظ على البيئة استتبابي عن الخلايا العصبية ، فضلا عن حماية الخلايا العصبية من أنواع الاكسجين التفاعلية (ريوس). CM - H2DCFDA هو مؤشر الخلية منفذة لوجود ريوس. CM - H 2 DCFDA يدخل الخلية كمركب غير الفلورسنت ، ويصبح بعد الفلورسنت esterases الخلوية إزالة مجموعات أسيتات ، ويتأكسد المجمع. عدد من الخلايا ، التي تقاس التدفق الخلوي ، التي تم العثور عليها لتكون الاستشعاع الأخضر دلالة على عدد من الخلايا التي هي في حالة الأكسدة. CM - H 2 DCFDA عرضة للأكسدة من قبل عدد كبير من ROS مختلفة. هذا النقص في الدقة ، فيما يتعلق التي يمكن أكسدة ريوس CM - H 2 DCFDA ، ويجعل هذا مركب الوصي قيمة لاستخدامها في المراحل الأولى من التحقيق المرضية ، كما يمكن استخدام هذا الاختبار للكشف عن وجود بيئة الأكسدة الخلوية بغض النظر عن الأكسجين الراديكالية أو مزيج من ROS هي المسؤولة عن الاوضاع الخلوية. حالما ثبت أن ريوس موجودة من قبل أكسدة DCFDA 2 CM - H ، ثم يمكن إجراء مزيد من التجارب لتحديد ما الذي تشارك ريوس أو مزيج من روس في عملية المرضية خاص. نتائج هذه الدراسة تثبت مع إضافة بيروكسيد الهيدروجين زيادة في DCFDA 2 CM - H يتألق تم الكشف عن النسبية للضوابط المالحة ، مشيرا إلى أن هذا الاختبار هو اختبار للكشف عن قيمة بيئة الأكسدة داخل الخلايا G355 - 5 ، وهي القطط خط خلية نجمية.
Protocol
1. ثقافة خلية من الخلايا النجمية القطط والعلاج مع H 2 O 2
- ثقافة خط الخلية G355 - 5 في قارورة 75 2 سم مع وسائل الإعلام بالإضافة إلى المواد الغذائية DMEM عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 حتى 60 ٪ متموجة (~ 5 أيام). استبدال وسائل الإعلام كل يوم 1-2 أو حسب الحاجة للحفاظ على ثقافة صحية.
- وسائل الإعلام وإزالة إضافة 2 مل من التربسين 0.25 ٪. رفع pipetting الخلايا لمدة 45 ق -- 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- نقل بسرعة إلى تعليق أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 10 مل من وسائل الإعلام. المزيج بلطف.
- أجهزة الطرد المركزي في 300 XG و 23 درجة مئوية لمدة 3 دقائق للحصول على بيليه. تجاهل طاف بيليه من دون إزعاج.
- إضافة مل 6-7 وسائل الإعلام الجديدة وresuspend الخلايا.
- إضافة ~ 1 مل من الخلايا إلى كل بئر من لوحة 6 - جيدا. إضافة 2-3 مل من وسائل الإعلام إلى كل بئر واحتضان متكدسة حتى 80-90 ٪.
- يعد حل 100μM من بيروكسيد (H 2 O 2) في وسائل الإعلام.
- إزالة وسائل الاعلام من كل بئر واستبدالها مع وسائل الإعلام سواء الطازجة 2 مل (السيطرة) ، 2 مل من H 2 O 2 (المعالجة) أو من 2ml DPBS. احتضان ثاني أكسيد الكربون في 37 ° C ، 5 2 ٪ لمدة 3 ساعة.
- إزالة الحلول وإضافة 1 مل من التربسين لرفع الخلايا. نقل الخلايا إلى أنبوب 1.7 مل تحتوي على إيبندورف DPBS مل 0.5. يجب أن يتم تنفيذ هذه الخطوة على كل جانب على حدة من أجل منع موت الخلايا من التربسين حضانة طويلة.
- تدور في 300 x ج لمدة 3 دقائق ، وتجاهل. resuspend وطاف في 1 مل من DPBS
2. تلطيخ لريوس
- وينبغي تنفيذ جميع الخطوات اللازمة لتلطيخ خارجا مع الحد الأدنى من التعرض للضوء لمنع التبييض.
- إضافة 1 ميكرولتر من CCCP 50 ملم على سيطرة إيجابية. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لمدة 5 دقائق.
- إضافة 5 ميكرولتر من 10 ملي CM - H حل DCFDA 2 إلى 2 H 2 O المجموعة. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO 2 لل15-30 دقيقة. عدم إضافة أية وصمة عار على عينة المالحة.
- غسل العينات مع 2 مل من DPBS لإزالة البقع المتبقية.
- تدور في 300 x ج لمدة 3 دقائق للحصول على بيليه.
- Resuspend الخلايا في 0.5 مل من DPBS. إضافة 1 PI ميكرولتر لكل عينة ، ما عدا المالحة.
- نقل العينات إلى أنبوب تدفق عداد الكريات 5ml.
- تعمل على تدفق عداد الكريات.
3. التدفق الخلوي
- تشغيل العينات على بيكمان كولتر FC500 (أو ما يعادلها) مجهزة ليزر الأرجون 488 نانومتر ، ويمر شريط التالية : 525 ، 775 نانومتر و620 ، عن ± 20 نانومتر.
- إعداد الضوابط المناسبة : الخلايا غير ملوثين ، CM - H 2 DCFDA الملون فقط ، PI فقط ، الملون المزدوج (مراقبة سلبية).
- جعل البروتوكول الذي يحتوي على histoplots التالية : FS مقابل SS ، PI مقابل CM - H DCFDA 2. ينبغي أن يكون أيضا رسوم بيانية التالية : عدد الخلايا مقابل FL1 ، وFL2 FL3 ، والتي تتطابق مع البقع.
- قبل تشغيل عينات ، والتحقق من المعدات والسوائل والحاويات من النفايات. الاحماء المعدات لا يقل عن 20 دقيقة.
- تنظيف المعدات وإجراء المعايرة مع الخرز المناسب وفقا لمعايير الشركات المصنعة.
- حدد البروتوكول الخاص وتشغيل العينات.
- تنظيف المعدات كما فعلت سابقا.
- تنظيف خط فراغ وفقا لمعايير الشركات المصنعة.
- إيقاف تدفق وتنظيف خط الرأس / فراغ.
- إيقاف البرامج والكمبيوتر.
4. ممثل النتائج :
وقد تم تحليل النتائج باستخدام التدفق الخلوي FlowJo 7.6 واستخدمت الضوابط وصمة عار لتعيين بموضوعية النابضة. تم الكشف على هذا الأساس ، تظهر الخلايا السليمة على الجهة اليسرى من الرسم البياني وريوس (الاكسدة) وتحول الخلايا إلى اليمين. الشكل 1 يبين نتائج تأثير بيروكسيد الهيدروجين في الخلايا النجمية القطط السليمة. واستخدمت بيانات من FL1 لقياس كثافة DCFDA 2 CM - H ، والذي يدل على وجود ريوس. كما هو متوقع ، تم الكشف عن ارتفاع كمية ريوس في العينة تعامل مع H 2 O 2. يتم عرض ذلك على الرسم البياني تحولا في شدة الفلورسنت من اليسار إلى اليمين. عند المقارنة بين الخلايا السليمة تعامل مع DMEM مقابل DPBS ، لم يكن هناك تغيير كبير في كمية ريوس (الشكل 2).
التدفق الخلوي الرقم 1. نتائج مستويات الاكسدة في الخلايا النجمية القطط صحية وتأثير H 2 O 2 على الخلايا السليمة. وتشير النتائج إلى أن H 2 O 2 يزيد من مستويات ريوس في الخلايا السليمة إلى خلايا بالمقارنة مع أي علاج (DMEM).
التدفق الخلوي الرقم 2. نتائج مستويات ريوس في الكشف عن الخلايا السليمة المحتضنة ل3hrs مع DPBS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بفعل آلية المقترحة في كثير من الأحيان من الفيروس الأضرار العصبية الاكسدة هي 1 ، 4 ، 7 ، 9 ، 13 ، 15 ، 16 ، 18-22 ، 27 ، 31. في الأساس ، يقترح أنه من خلال التعرض لفيروسات الدبقية (الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة) الراديكاليين إطلاق الأكسجين التفاعلية ، مثل هيدروكسيد ، أنيون الفائق ، وأكسيد النتريك ، و / أو بيروكسيد الهيدروجين ، والتي تكون سامة للخلايا العصبية. وبالمثل ، الاكسدة وقد اقترح أيضا كآلية رئيسية في الميثامفيتامين مرضية بفعل العصبية 2 ، 6 ، 17. منذ مهتمة مجموعتنا في آثار كل من الفيروس وتعاطي المخدرات على الجهاز العصبي المركزي ، انتخبنا لاستخدام الفحص السريع لتحديد الحالي ريوس الزائدة في الخلايا النجمية. ويتم إنتاج معظم الجلوتاثيون العصبية التي النجمية وتسليمها بعد ذلك إلى الخلايا العصبية 5 ، 8 ، 10-12 ، 24 ، 26 ، 29 ، 30. وبالتالي ، فإن دور الخلايا النجمية في الاكسدة المهم في الحفاظ على بيئة استتبابي عن الخلايا العصبية ، فضلا عن حماية الخلايا العصبية من ريوس ، والسبب هو أنه تم اختيار خلية نجمية الثقافات لهذه الدراسة.
وكما هو معروف CM - H 2 DCFDA ك 2 "، و7' - dichlorofluorescein H2DCF. CM - H 2 DCFDA هو مؤشر الخلية منفذة لوجود أنواع الاكسجين التفاعلية. CM - H 2 DCFDA يدخل الخلية كمركب غير فلوري ، الذي يصبح بعد الفلورسنت esterases الخلوية إزالة مجموعات أسيتات ، ومجمع يصبح المؤكسدة. مرة واحدة داخل الخلية ومجموعات أسيتات يتم إزالتها ، يمكن أن تتأكسد CM - H 2 DCFDA عدد من الأنواع ريوس ، بما في ذلك اكسيد النيتريك ، الأنيونات peroxynitrite ، بيروكسيد الهيدروجين ، وhydroperoxides العضوية 3 ، 14 ، 25 ، مما أدى إلى الأخضر فلوري المنتج 23 و 28. هذا الافتقار إلى التحديد في ريوس ، والتي يمكن أكسدة CM - H 2 DCFDA ، يجعل من كاشف قيمة في المراحل الأولى من التحقيق المرضية ، والتي يعتقد آلية الاكسدة أن تلعب دورا ، لكنه غير معروف التي قد تكون جذرية الأكسجين المعنية ، بدلا من اختبار كل على حدة ريوس. حالما ثبت أن ريوس موجودة من قبل أكسدة DCFDA 2 CM - H ، ثم يمكن إجراء مزيد من التجارب لتحديد ما الذي تشارك ريوس أو مزيج من روس في عملية المرضية خاص. نتائج هذه الدراسة تثبت مع إضافة بيروكسيد الهيدروجين زيادة في DCFDA 2 CM - H يتألق عندما تم الكشف عن مقارنة لسيطرة المالحة ، مشيرا إلى أن هذا الاختبار هو اختبار للكشف عن قيمة بيئة الأكسدة داخل 5 - G355 الخلايا ، وهو الماكر خط خلية نجمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
نشكر منتجات ReadiSorb لدعمهم السخي لهذه الدراسات.
Acknowledgments
نشكر منتجات ReadiSorb لدعمهم السخي لهذه الدراسات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| MEM Vitamins | Cellgro | 25-020-cl | 1% (v/v) |
| L-glutamine | Hyclone | 17-605E | 1% (v/v) |
| Non Essential Amino Acids | Hyclone | 25-025-cl | 1% (v/v) |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | 20% (v/v) |
| Essential Amino Acids | Cellgro | 25-030-cl | 0.2% (v/v) |
| 500ml vacuum filtration system | VWR international | 87006-076 | |
| 15 ml conical tubes | Falcon BD | 352097 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Falcon BD | 353136 | |
| 6 well tissue culture plate | Falcon BD | 353224 | |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170-10mg | |
| Trypsin | Lonza Inc. | 17-160F | |
| H2O2 | Sigma-Aldrich | H6520 | |
| HyQ Antibiotic | Hyclone | SV30079.01 | 0.1% (v/v) |
| G355-5 cells | ATCC | CRL-2033 | Normal feline brain |
References
- Bukrinsky, M. I., Nottet, H. S., Schmidtmayerova, H. L., Dubrovsky, H., Flanagan, C. R., Mullins, M. E., Lipton, S. A., Gendelman, H. E. Regulation of nitric oxide synthase activity in human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected monocytes: implications for HIV-associated neurological disease. J Exp Med. 181, 735-745 (1995).
- Cadet, J. L., Ali, S., Epstein, C. Involvement of oxygen-based radicals in methamphetamine-induced neurotoxicity: evidence from the use of CuZnSOD transgenic mice. Ann N Y Acad Sci. 738, 388-3891 (1994).
- Cathcart, R., Schwiers, E., Ames, B. N. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay. Anal Biochem. 134, 111-116 (1983).
- Chao, C. C., Hu, S., Peterson, P. K. Glia: the not so innocent bystanders. J Neurovirol. 2, 234-239 (1996).
- Cooper, A. J., Kristal, B. S. Multiple roles of glutathione in the central nervous system. Biol Chem. 378, 793-802 (1997).
- Cubells, J. F., Rayport, S., Rajendran, G., Sulzer, D. Methamphetamine neurotoxicity involves vacuolation of endocytic organelles and dopamine-dependent intracellular oxidative stress. J Neurosci. 14, 2260-2271 (1994).
- Dawson, V. L., Dawson, T. M., Uhl, G. R., Snyder, S. H. Human immunodeficiency virus type 1 coat protein neurotoxicity mediated by nitric oxide in primary cortical cultures. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 3256-329 (1993).
- Desagher, S., Glowinski, J., Premont, J. Astrocytes protect neurons from hydrogen peroxide toxicity. J Neurosci. 16, 2553-2562 (1996).
- Dewhurst, S., Gelbard, H. A., Fine, S. M.
- Dringen, R. Metabolism and functions of glutathione in brain. Prog Neurobiol. 62, 649-671 (2000).
- Dringen, R., Hamprecht, B. Glutathione restoration as indicator for cellular metabolism of astroglial cells. Dev Neurosci. 20, 401-407 (1998).
- Dringen, R., Pfeiffer, B., Hamprecht, B. Synthesis of the Antioxidant Glutathione in Neurons: Supply by Astrocytes of CysGly as Precursor for Neuronal Glutathione. J Neurosci. 19, 562-569 (1999).
- Everall, I. P. H. udson, L, R. W. K. erwin Decreased absolute levels of ascorbic acid and unaltered vasoactive intestinal polypeptide receptor binding in the frontal cortex in acquired immunodeficiency syndrome. Neurosci Lett. 224, 119-1122 (1997).
- Gabriel, C., Camins, A., Sureda, F. X., Aquirre, L., Escubedo, E., Pallas, M., Camarasa, J. Determination of nitric oxide generation in mammalian neurons using dichlorofluorescin diacetate and flow cytometry. J Pharmacol Toxicol Methods. 38, 93-938 (1997).
- Gendelman, H. E., Genis, P., Jett, M., Zhai, Q. H., Nottet, H. S. An experimental model system for HIV-1-induced brain injury. Adv Neuroimmunol. 4, 189-1893 (1994).
- Hayman, M., Arbuthnott, G., Harkiss, G., Brace, H., Filippi, P., Philippon, V., Thomson, D., Vigne, R., Wright, A. Neurotoxicity of peptide analogues of the transactivating protein tat from Maedi-Visna virus and human immunodeficiency virus. Neuroscience. 53, 1-6 (1993).
- Hirata, H., Ladenheim, B., Rothman, R. B., Epstein, C., Cadet, J. L. Methamphetamine-induced serotonin neurotoxicity is mediated by superoxide radicals. Brain Res. , 677-6345 (1995).
- Koka, P., He, K., Zack, J. A., Kitchen, S., Peacock, W., Fried, I., Tran, T., Yashar, S. S., Merrill, J. E. Human immunodeficiency virus 1 envelope proteins induce interleukin 1, tumor necrosis factor alpha, and nitric oxide in glial cultures derived from fetal, neonatal, and adult human brain. J Exp Med. 182, 941-951 (1995).
- Kong, L. Y., Wilson, B. C., McMillian, M. K., Bing, G., Hudson, P. M., Hong, J. S. The effects of the HIV-1 envelope protein gp120 on the production of nitric oxide and proinflammatory cytokines in mixed glial cell cultures. Cell Immunol. 172, 77-83 (1996).
- Koutsilieri, E., Gotz, M. E., Sopper, S., Sauer, U., Demuth, M., ter Meulen, V., Riederer, P. Regulation of glutathione and cell toxicity following exposure to neurotropic substances and human immunodeficiency virus-1 in vitro. J Neurovirol. 3, 342-349 (1997).
- Lipton, S. A. Similarity of neuronal cell injury and death in AIDS dementia and focal cerebral ischemia: potential treatment with NMDA open-channel blockers and nitric oxide-related species. Brain Pathol. 6, 507-517 (1996).
- Lipton, S. A., Yeh, M., Dreyer, E. B. Update on current models of HIV-related neuronal injury: platelet-activating factor, arachidonic acid and nitric oxide. Adv Neuroimmunol. 4, 181-188 (1994).
- Mills, E. M., Takeda, K., Yu, Z. X., Ferrans, V., Katagiri, Y., Jiang, H., Lavigne, M. C., Leto, T. L., Guroff, G. Nerve growth factor treatment prevents the increase in superoxide produced by epidermal growth factor in PC12 cells. J Biol Chem. 273, 22165-22168 (1998).
- Peuchen, S., Duchen, M. R., Clark, J. B. Modulation of the glutathione redox state in adult astrocytes. Biochem Soc Trans. 24, 449S-449S (1996).
- Possel, H., Noack, H., Augustin, W., Keilhoff, G., Wolf, G. 2,7-Dihydrodichlorofluorescein diacetate as a fluorescent marker for peroxynitrite formation. FEBS Lett. 416, 175-178 (1997).
- Sagara, J., Makino, N., Bannai, S. Glutathione efflux from cultured astrocytes. J Neurochem. 66, 1876-1881 (1996).
- Stefano, G. B., Smith, E. M., Paemen, L. R., Hughes, T. K. Jr HIV gp120 associated neurological deficits: a potential role for nitric oxide and other signal molecules. Advances in Neuroimmunology. 3, 47-57 (1993).
- Sundaresan, M., Yu, Z. X., Ferrans, V. J., Irani, K., Finkel, T. Requirement for generation of H2O2 for platelet-derived growth factor signal transduction. Science. 270, 296-299 (1995).
- Wang, X. F., Cynader, M. S. Astrocytes provide cysteine to neurons by releasing glutathione. J Neurochem. 74, 1434-1442 (2000).
- Wilson, J. X. Antioxidant defense of the brain: a role for astrocytes. Can J Physiol Pharmacol. 75, 1149-1163 (1997).
- Zenger, E., Collisson, E. W., Barhoumi, R., Burghardt, R. C., Danave, I. R., Tiffany-Castiglioni, E. Laser cytometric analysis of FIV-induced injury in astroglia. Glia. 13, 92-100 (1995).
